选择性近红外激光热疗对人肝癌细胞抑制作用的研究

曲华伟,张阳德,陈玉祥,赵劲风,王吉伟,何剪太

原发性肝癌是世界上最常见且恶性程度最高的肿瘤之一, 发病率在恶性肿瘤中位居世界第 5位,病死率位居第 3位[1]。传统的手术治疗、放疗、化疗等都不能对其彻底治愈。因此,研究探索新疗法具有重要意义。近年来,随着近红外激光技术的研究进展,在近红外激光水平上开展肿瘤热疗引起了人们的广泛兴趣。本研究通过观察近红外激光 (808 nm)诱导产热对肝癌进行体内、体外的实验研究,旨在为开辟新的有效的肝癌治疗途径提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞株及实验动物 人肝癌 HepG2细胞,由中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心传代培养。BALB/N裸鼠 56只,4～6周龄,22～25 g,雄性,饲养于中南大学动物学部层流动物房。

1.2 方法 体外实验:(1)人肝癌 HepG2细胞贴壁生长48 h,热疗组分别按激光功率 1、2、3、4 W各照射 10 min,对照组 Hep G2细胞未照射,继续培养 24 h,然后用苔盼蓝染色后于倒置显微镜下拍照;(2)细胞接种于 96孔培养板中,培养 48 h后分别按不同功率近红外激光 (1、2、3、4 W)照射 10 min,继续培养,进行 MTT实验;(3)肿瘤细胞传代后制成单细胞悬液,接种于 24孔培养板中,并设对照组,近红外激光按不同功率 (1、2、3、4 W)分别照射 10 min,24 h后收集细胞,接种于 96孔培养板中,每 24 h计算细胞数量,连续 4次。

体内实验:将 30只移植性人肝癌裸鼠按随机数字表法分为对照组和热疗组,热疗组又分为 1 W照射组、2 W照射组、3 W照射组和 4 W照射组,每组6只。各热疗组裸鼠分别给予不同功率近红外激光照射10 min,每3 d照射 1次,观察肿瘤的生长情况。8周后治疗结束,处死裸鼠,剥离瘤体,观察肿瘤体积变化。用苏木素 -伊红染色观察对照组与各热疗组裸鼠移植瘤组织的病理变化。

1.3 观察指标 体外实验:激光热疗后细胞形态变化;MTT检测激光对细胞增殖的影响;细胞计数观察激光热疗对细胞数量的影响。体内实验:观察热疗后裸鼠移植瘤体积变化及其组织病理学改变。

1.4 统计学方法 采用 SPSS 10.0统计软件包进行统计分析。计量资料用 (x±s)表示,采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人肝癌 Hep G2细胞体外实验结果

2.1.1 近红外激光热疗对肝癌 HepG2细胞形态的影响 对照组细胞形态规则,未见明显细胞破裂及碎片 (见图 1A)。热疗组细胞变形、坏死,细胞碎片逐渐增多,细胞贴壁减少(见图 1B)。观察近红外激光照射区与非照射区可发现,右下方的照射区内细胞变形,碎片增多,贴壁减少,细胞壁损伤,苔盼蓝染色;而左上方的非照射区细胞形态正常,贴壁良好,未被苔盼蓝染色 (见图1C)。近红外激光照射范围内细胞坏死明显,范围外细胞正常。两者界限明显,显示近红外激光具有显著的选择性 (见图1D)。

2.1.2 近红外激光热疗对肝癌 HepG2细胞增殖的影响 近红外激光热疗对肝癌 Hep G2细胞增殖有显著的抑制作用。且随着激光热疗功率的增加,细胞抑制率也增加 (P＜0.05,见表1)。

2.1.3 近红外激光热疗对肝癌 HepG2细胞生长抑制的影响不同功率近红外激光诱导下,肝癌细胞株细胞生长数量较对照组显著降低,差异有统计学意义 (P＜0.05,见表 2)。

2.2 近红外激光热疗对肝癌裸鼠体内实验结果

2.2.1 近红外激光热疗对肝癌裸鼠肿瘤体积的影响 近红外激光热疗组裸鼠移植瘤体积缩小,瘤体表面不光滑,可见坏死及焦痂形成。对照组移植瘤体积逐渐增大,表面光滑 (见图2)。各热疗组裸鼠肿瘤体积与对照组比较,差异均有统计学意义 (P＜0.05,见表 3)。

2.2.2 肝癌裸鼠移植瘤组织近红外激光照射前后组织病理变化 对照组肿瘤细胞生长良好,细胞分裂相多见。而热疗组裸鼠组织均出现不同程度的肿瘤坏死,坏死面积明显高于对照组(见图 3)。

表 1 不同功率近红外激光热疗对 HepG2细胞作用的 MTT结果 (x±s)Table 1 MTT of thermal ablation with near-infrared laser of HepG2 cells

表 2 不同功率近红外激光作用HepG2细胞不同时间时细胞生长数量(x±s,1×104)Table 2 Number of HepG2 cell by thermal ablation with near-infrared laser of cells

表 3 不同功率近红外激光热疗对裸鼠肿瘤体积的抑制作用Table 3 Volumeinhibition of tumor after thermal ablation with near-infrared laser

图 2 裸鼠成瘤及激光照射肿瘤变化Figure 2 Tumor by thermal ablation with near-infrared laser

图 1 近红外激光热疗对肝癌 HepG2细胞形态的影响Figur e 1 Effect of HepG2 cells change before and after thermal ablation with near-infrared laser

图 3 裸鼠成瘤激光照射前后的组织病理变化Figur e 3 Pathology change of tumor tissue beforeand after thermal ablation with near-infrared laser

3 讨论

原发性肝癌是世界上最常见且恶性程度最高的肿瘤之一,发病率在恶性肿瘤中位居世界第 5位,病死率位居第 3位。目前,肝癌治疗首选手术切除。由于我国肝癌大部分伴有肝硬化或慢性肝炎,按大范围的规则肝切除可导致并发症的发生率及病死率增加[2]。而局部小范围切除虽可以降低病死率,但往往导致肿瘤切除不彻底,术后复发率升高。而对于不能手术的肝癌患者目前较为常用的有聚焦超声[3]、射频[4]、微波、冷冻[5]等通过改变瘤内温度而杀死肿瘤的方法。这些方法的共同点就是在肝脏内部形成一个规则的坏死区域,从而达到使肿瘤坏死的目的。以上治疗方式都具有治疗范围外形规则的特点,当肿瘤临近肝门区或下腔静脉等重要器官时,治疗显得较为棘手,为降低手术风险往往避开这些区域,从而导致肿瘤切除不彻底,术后复发率升高。

本研究采用近红外激光热疗治疗肝癌的方法与以上治疗方式不同。近红外激光热疗的原理是利用激光产生热效应和肿瘤不耐热的特点对肿瘤进行治疗,导致肿瘤凝固坏死,以达到灭活肿瘤和减少瘤负荷的目的[6]。近红外激光照射可以根据肿瘤形状的不同改变照射范围,从而达到选择性热疗的效果。正如图 1C与图 1D中所见,根据激光照射范围的不同,坏死细胞与正常细胞之间界限明显。可见,近红外激光热疗具有选择性特点。该治疗方法选择性较好,尤适用于那些肿瘤外形不规则,或临近肝门区或下腔静脉等重要器官的患者,从而彻底杀死肿瘤,降低术后复发率。

近年来,随着纳米技术的发展,在纳米水平上研制纳米磁性载体和药物又引起了人们的广泛关注。颜士岩等[7]研究的Fe2O3纳米磁流体热疗治疗肝癌就获得了不错的效果。但该研究也存在某些不足。首先,纳米磁流体热疗温度较低,最高至54℃,仅限于较低温度诱导肿瘤的凋亡,并不能直接杀死肿瘤,也就不能达到根治的目的;其次,由于磁流体热疗温度较低,其持续加热时间较长 (60～90 min),高频交变磁场照射的时间也就增加,对正常组织是否有毒副作用尚有待探讨。本研究采用的选择性近红外激光热疗可直接杀死肿瘤组织。由于温度较高,激光照射时间较短,对正常组织损害较小,是一种较为理想的选择性热疗方式。本研究体外实验结果显示,经近红外激光照射后,肝癌 HepG2细胞变性、坏死,且照射区坏死细胞与非照射区正常细胞界限明显,说明近红外激光有显著的选择性。经过近红外激光照射后,Hep G2细胞增殖和细胞生长明显受抑制,且激光功率越高,抑制率也越高。体内实验结果显示,近红外激光照射后,肝癌裸鼠肿瘤体积较未照射的肝癌裸鼠显著缩小,且激光功率越高,肿瘤体积抑制率也越高。

目前关于近红外激光热疗治疗肿瘤的研究国内尚未见报道。我们利用选择性近红外激光诱导产热的特点,将其应用到肿瘤治疗中,进行了一系列的体内体外实验,为今后近红外激光热疗应用于临床积累了一定的实验数据,初步验证了该治疗方法的可行性和有效性。

1 叶家才,崔书中,巴明臣.原发性肝癌的流行病学特征及其危险因素 [J].实用医学杂志,2008,24(10):1839-1841.

2 张清华,刘景丰 .原发性肝癌治疗进展 [J].医学综述,2008,14(10):1479-1481.

3 白晋,李发琪,杜永洪.高强度聚焦超声形成生物学焦域的剂量学研究 [J].第三军医大学学报,2004,26(15):1378-1380.

4 张隆群,王济明.射频消融与手术切除治疗肝癌并发症及生存率的临床对照研究 [J].第三军医大学学报,2007,29(5):457-459.

5 周霖,杨永平,刘静.氩氦刀冷冻治疗早期肝癌疗效分析 [J].胃肠病学和肝病学杂志,2008,17(12):1000-1002.

6 Muralidharan V,Christophi C.Interstitial laser thermotherapy in the treatment of colorectal liver metastases[J].J Surg Oncol,2001,76(1):73-81.

7 颜士岩,张东生,郑杰.Fe2O3纳米磁流体热疗治疗肝癌 [J].中华实验外科杂志,2004,21(12):1443-1446.