冻融循环对甲壳素溶解性的影响

刘廷国，李 斌，宋 雪，陆志敏，王瑞侠，汪 新

(1.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070;2.池州学院化学与食品科学系，安徽池州247100)

冻融循环对甲壳素溶解性的影响

刘廷国1，2，李 斌1，*，宋 雪1，陆志敏2，王瑞侠2，汪 新2

(1.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070;2.池州学院化学与食品科学系，安徽池州247100)

甲壳素具有许多独特的性质，但不能溶于常规溶剂，极大地限制了其广泛应用，提高其溶解性成为迫切需要解决的问题。对甲壳素和浓NaOH混合物进行反复冻融处理，慢速冷冻/低温解冻的冻融循环处理过程中冰晶的反复形成和重结晶作用，能够破坏甲壳素凝聚态特别是晶态结构，促使甲壳素溶于一定浓度的NaOH溶液中。探讨了冻融次数、冷冻温度、NaOH浓度和甲壳素与溶剂的比例分别对溶解性的影响。结果表明，－18℃、40%NaOH(甲壳素∶水=1∶4，W/V)经过3次冻融循环处理，可以形成均一、透明的甲壳素均相溶液，甲壳素终浓度约为4%，NaOH终浓度约为10%，为用均相脱乙酰法制备半脱乙酰水溶性甲壳素提供前提。结果表明，冻融循环处理能显著降低甲壳素分子内和分子间强氢键相互作用，破坏甲壳素分子致密的晶体结构，使分子结构紊乱，从而为制备水溶性甲壳素提供了可能。

甲壳素，循环冻融，氢键，晶体结构

Abstract:Due to the special chemical structure，chitin had many unique properties.However，it was insoluble in water，diluted acid，alkaline solution and common organic solvents.This was the major problem that confronted the application of chitin，hence it was an urgent need to resolve how to improve the poor solubility of chitin.This paper explored the effects of freezing－thawing cyclic(FTC)treatment on the solubility in alkaline solution and condensed state structure of chitin.The mixture of chitin and concentrated NaOH solutions was freezed and thawed，repeatedly.With slowly freezing and low temperature thawing cycle process that could destruct the condensed matter especially the crystalline state structure more thoroughly，because of the ice crystals’repeatedly formed and recrystallizated.Therefore，chitin could dissolve in a certain concentration diluted NaOH after some times of FTC treatment.Effects of FTC times，freezing temperature，NaOH concentration and the ratio of chitin and water on the solubility of chitin were investigated.The results showed that via three times of FTC treatment at－18℃ with NaOH concentration of 40%(the ratio of chitin and water was 1∶4，W/V)，chitin could be completely dissolved in NaOH aqueous solution and formed a limpidity homogeneous solution with a chitin concentration about 4%(W/W)and a final NaOH concentration of approximately 10%(W/W)，which was possible to prepare partial N－deacetylated water－soluble－chitin.The results indicated that the formation and growth of ice crystal in the slowly freezing process could break the intra－and/or inter－molecular hydrogen bonds interaction，and destruct the compact crystal structure and decline the crystallinity of chitin，it could also disorder the ordered molecular structure，which might be used to prepare water－soluble－chitin.

Key words:chitin;freezing－thawing cyclic treatment;hydrogen bonds;crystalline structure

甲壳素是迄今为止发现的唯一大量存在的天然碱性多糖，也是除蛋白质外数量最大的天然含氮有机化合物，广泛存在于虾、蟹、昆虫的甲壳，软体动物的壳和外骨骼以及某些真菌的细胞壁中，每年自然界生物合成量将近100亿t，是仅次于纤维素的天然可再生资源［1－2］。由性质活泼的伯胺基取代了化学惰性的乙酰氨基，这赋予壳聚糖许多独一无二的性质:良好的生物相容性、广谱抗菌性、生物可降解性、重金属离子螯合性、成膜性和成纤维性等［3－4］。使甲壳素、壳聚糖及其衍生物在生物医用材料、废水处理、纺织印染、食品、化妆品和农业等领域均有很高的应用价值［5－6］。壳聚糖存在大量亲水基团，很容易吸附水分子，对材料的结构和性能影响很大［7］，限制了其在材料领域的广泛应用。而分子内、分子间强氢键相互作用的存在，致使甲壳素不溶于水、稀酸、稀碱、浓碱和一般有机溶剂，浓硫酸、盐酸、磷酸和无水甲酸可使其溶解，但同时严重降解其分子链［8］。因此，提高甲壳素溶解性，寻找对其结构影响小，溶液性质稳定的良溶剂成为近年科学家广泛关注的热点之一［9－10］。在反复冻融过程中，冰晶的存在和生长，会不同程度地对碳水化合物高聚物微观结构造成机械损伤［11－12］。对碱甲壳素进行冻融循环(freezingthawing cyclic，FTC)处理，制备出一种高浓度甲壳素均相溶液。通过研究冻融参数对溶解性的影响，为探索廉价、方便的甲壳素良溶剂提供一种新思路，为FTC法在碳水化合物加工中的广泛应用积累理论和实践经验，也为甲壳素在更大范围内的广泛应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲壳素 食品级，脱乙酰度21.11%，过80目筛，浙江金壳生物化学有限公司;实验用水 均为双蒸水;化学试剂 均为分析纯。

冰柜 BC/BD－190S，控温范围4～－37℃，上下波动0.5℃，青岛海尔特种电冰柜有限公司;数字旋转粘度计 NDJ－8S，上海精密科学仪器有限公司;数显恒温水浴锅 HH－4，国华电器有限公司;真空干燥箱 DZF－6050，上海精宏实验设备有限公司;冷冻离心机 BC－010TY2265，美国Beckman公司;分析天平 AC2105，德国Sartorius公司。

1.2 实验方法

1.2.1 碱甲壳素冻融循环处理 甲壳素粉末与40%浓度NaOH溶液(甲壳素∶水=1∶4，W/V)充分混匀，密封后室温放置8h，使甲壳素颗粒充分浸润，－18℃分别冷冻处理1～6d，每个样品做三个平行。每天将样品从－18℃冰箱取出，40℃恒温水浴解冻，样品中心温度升至40℃时取出重新冷冻。处理结束的样品用蒸馏水稀释至甲壳素终浓度为4%。样品溶液于4℃、10000r/min离心20min，收集上清液。不溶物依次用10%NaOH溶液、1mol/L稀盐酸溶液、蒸馏水、70%(V/V)乙醇、95%乙醇洗涤，直至用0.1mol/L AgNO3检测不含Cl－，60℃真空干燥后准确称重，甲壳素溶解性(Solubility，S，%)按下式计算:

式中:W0为原始甲壳素质量，g;W1为不溶的甲壳素质量，g。

分别考察碱浓度、冷冻温度以及原料与溶剂之比对甲壳素－碱混合物经过3次冻融循环后溶解性的影响。

1.2.2 碱甲壳素溶液稳定性 甲壳素与40%浓度NaOH混合物经过2次FTC处理，用水稀释甲壳素终浓度为4%，NaOH终浓度约为10%，样品溶液于4℃、10000r/min离心20min，收集上清液。恒温放置，每隔一定时间，取一定量上清液倾入专用测量杯中，用NDJ－8S数显粘度计(4号转子，12r/min)测量样品溶液表观粘度，每次测三个平行取平均值。

2 结果与讨论

2.1 冻融循环处理对甲壳素溶解性的影响

由于甲壳素的分子结构高度有序，不溶于酸、碱和一般有机溶剂，限制了其在医药卫生、生物工程等领域的广泛应用，因此，提高甲壳素的溶解性是科学家普遍关注的热点问题之一。目前研究较多的是强氢键开裂剂，如卤代醇、卤代醇/酸、酰胺/氯化锂以及尿素/强碱溶液等［1］。

甲壳素N－乙酰葡萄糖残基上的活性羟基，虽比小分子醇羟基的反应活性小得多，但仍然能够与强碱溶液发生取代反应，生成碱甲壳素。1940年Thor等人将甲壳素分散到20倍体积的43%NaOH溶液中，最早制备了钠甲壳素［1］。1975年Sannan等人报道，将3g甲壳素与75g强碱溶液(含NaOH 30g)混合并真空脱气，添加225g碎冰在低于0℃的低温条件下强烈搅拌可以制备甲壳素浓度约为1%，NaOH浓度约为10%的甲壳素均相溶液［13］。Einbu等人用同样的方法制备了甲壳素终浓度为0.225%，NaOH浓度为10%的甲壳素溶液，并研究了其溶液性质，证明强碱溶液是甲壳素的优良溶剂［14］。Hu等人首次报道8%NaOH/4%尿素溶液也可以作为甲壳素的优良溶剂，不但可以得到稳定的溶液，而且对甲壳素的固体结构影响极小［15］。然而，此前的研究只能制备甲壳素的稀溶液，不利于采用均相脱乙酰法批量制备水溶性甲壳素;而且后续处理繁琐、冗长，需要消耗大量有机试剂，不但浪费而且容易造成二次污染。

图1 冻融次数对甲壳素在碱溶液中溶解性的影响

2.1.1 冻融次数对甲壳素溶解性的影响 图1给出了经过循环冻融处理的甲壳素在碱溶液中的溶解性变化情况。溶解性总体趋势上随处理时间的延长而增大。在最初3d溶解性随处理时间延长迅速增加，第3d甲壳素在碱溶液中的溶解性已经超过95%，此后继续处理溶解性几乎不变。这说明在冻融处理后期，NaOH向甲壳素颗粒内部渗透阻力增大，对分子结构的破坏作用减小，溶解性变化不明显，从经济学与周期性角度考虑冻融3d是较佳选择。经过3d处理即能得到均一、透明的甲壳素溶液，甲壳素终浓度约为4%，NaOH终浓度为10%。与文献［13］报道相比，甲壳素浓度提高了4倍，制备相同浓度的碱甲壳素溶液NaOH用量降低到原来的1/4，极大降低了碱的用量，而且克服了文献报道方法由于甲壳素溶液浓度低［13－14］，溶剂体系复杂［15］，导致后处理冗长、繁琐、需消耗大量有机溶剂的缺点，可以部分缓解环境污染。

2.1.2 NaOH浓度对甲壳素溶解性的影响 在NaOH溶液作用下，甲壳素分子一方面脱去乙酰基，转变为分子中含氨基的壳聚糖;另一方面，C6位－OH与NaOH发生成盐反应，形成钠甲壳素，从而可以溶于氢氧化钠溶液。图2描述了不同NaOH浓度对甲壳素溶解性的影响。由图中数据可知，甲壳素在10%、20%NaOH作用下几乎未溶解;而NaOH浓度在20%和30%之间时，溶解度随着NaOH浓度的升高而迅速增大;当NaOH的浓度大于40%时，溶解度又随之减小。这可能是因为:当NaOH含量太低时，OH－的含量不能满足甲壳素脱乙酰胺基的含量要求;而且渗透性不强，不足以破坏甲壳素致密的晶体结构，因此难于溶解。NaOH浓度超过30%后，已经可以满足脱乙酰反应对NaOH浓度的需要，另外也有较强渗透性，可以大幅度破坏甲壳素晶体结构，提高溶解性，但是再增加NaOH浓度并不能提高样品溶解性，前期研究工作已经表明纯粹通过提高碱浓度来加速脱乙酰反应进程并不现实［16］，出于经济实用角度考虑，在冻融循环条件下，30%～40%NaOH是最佳的工业选择。

图2 NaOH浓度对甲壳素在碱溶液中溶解性的影响

2.1.3 冷冻温度对甲壳素溶解性的影响 冷冻温度对甲壳素溶解性也有着极显著影响。如图3所示，－18℃和－25℃时溶解性最高，超过90%，随着温度升高或降低，溶解性变化不明显，维持在60%～70%，这主要与冻融引起甲壳素溶解的机理有关。在反复冷冻和低温融化的过程中，水分子和NaOH分子在冰晶反复形成和生长过程中产生的机械力作用下突破甲壳素颗粒致密的结构限制，进入甲壳素颗粒内部，在慢速冻结过程中(－18℃和－25℃)，冰晶的形成和生长均较缓慢，形成的冰晶较大，产生的破坏力较强，能够较多破坏分子间和分子内氢键，促进甲壳素溶解。但是，当处理温度低于－30℃，冻结和扩散的过程短暂，形成的冰晶比较细腻，产生的破坏力不够大，因此不能大幅度提高溶解性。在－18℃以上的温度处理，由于浓NaOH溶液尚未冻结，未有足够的冰晶用来破坏氢键，且其扩散性亦不强，因此也不能显著提高甲壳素溶解性。

2.1.4 料液比对甲壳素溶解性的影响 由图4可知，甲壳素与溶剂的比例低于1∶4时(如1∶3)，溶解性较低，1∶4 时，溶解性最好，大于1∶4 时，随着 NaOH 用量的增加并不能显著提高样品溶解性。非常有趣的是，料液比1∶10时，样品的溶解性较差，几乎未溶解，但离心后的沉淀用10%碱液洗涤时又有大量残渣溶于NaOH溶液中。可能原因是Na+和OH－均能产生较强的净结构形成效应，当NaOH绝对过量时，由冻融作用形成的强制渗透作用不足以抵消净结构形成效应带来的渗透阻力。由此可知，冻融循环条件下，料液比1∶4时甲壳素溶解性最好，料液比过低，溶液不能充分地渗入甲壳素颗粒内部，接触不均匀，即使在反复冻融的情况下亦不能充分破坏甲壳素晶体结构，溶解度自然不高;料液比过高，净结构形成效应使大量多余的水聚集在粉末颗粒外表面，使反复冻融过程中形成的机械力破坏作用仅仅发生在甲壳素颗粒的表层或浅表层，难于最大限度地提高溶解性。

图3 冷冻温度对甲壳素在碱溶液中溶解性的影响

图4 料液比对甲壳素在碱溶液中溶解性的影响

2.1.5 甲壳素溶解机理探讨 图5尝试图示了甲壳素分子在浓碱液中于冻融循环处理过程中的溶解过程。首先，甲壳素在室温条件下在浓碱溶液中充分吸附膨润，此时由于甲壳素结构的致密性，大量的NaOH和水分子很难渗透进甲壳素分子内部，只能吸附在其表层或浅表层(a);在冷冻条件下，随温度降低，水分子逐渐冻结，由于冷冻浓缩效应，使NaOH的渗透性加大，部分水分子和NaOH分子进入甲壳素颗粒内部，并且脱乙酰过程缓慢进行(b);随着温度的继续下降，低温效应取代浓缩效应，NaOH和水分子的渗透作用停止，但已经渗透进去的水分子和NaOH分子开始形成冰晶并缓慢长大，在冰晶机械力的作用下部分分子间氢键被打破(c);样品经缓慢解冻，并重新冻结，在冰晶的不断作用下，越来越多的氢键被破坏，导致甲壳素分子最终能够溶于碱溶液中(d)。

2.2 放置时间对甲壳素浓溶液稳定性的影响

甲壳素溶解于NaOH溶液后即形成一种高聚物溶液，具有一定的粘度，在存放过程中粘度的变化，可以作为衡量甲壳素溶液稳定性的一个指标。高聚物已有研究表明，相同条件下，相对分子质量越大，表观粘度越大，这是因为在大量出现链缠结的临界分子量以上，分子链愈长，分子间的缠结点愈多，表观粘度就愈大，可以通过溶液粘度的变化近似反映分子量大小的变化［17］。图6描述了甲壳素均相溶液在放置过程中表观粘度的变化情况。

图5 冻融循环处理甲壳素在碱溶液中的溶解示意图

图6 静置时间对甲壳素溶液表观粘度的影响

从图6中可以看出，甲壳素碱溶液的粘度在放置初期(84h左右)随时间的推移不断下降，起初下降速率较快，36h时表观粘度下降约1/2，之后逐渐变慢，几乎不变;84h后粘度骤然上升，96h左右几乎呈凝胶状。β糖苷键对酸不稳定，对碱稳定，但在高浓度碱长时间作用下仍会不同程度地发生水解反应。反应起始阶段，甲壳素在NaOH的作用下迅速脱乙酰并发生糖苷键水解反应，致使分子量迅速下降，分子内与分子间氢键被破坏，结构变得松散，粘度不断下降;继续放置，脱乙酰反应继续进行，然而，随脱乙酰度(DDA)的增加，分子中氨基含量逐渐增加，分子碱性逐渐增加，分子间和分子内重新形成氢键网络，分子开始趋向于凝胶，这与壳聚糖稀酸溶液遇碱发生絮凝的现象极其相似。散乱无序的甲壳素分子在氢键作用下逐渐聚集并开始交联形成凝胶网络，粘度降低得越来越慢;当形成凝胶的趋势大于降解程度时，甲壳素分子迅速凝聚，粘度突然升高，直到最后形成半固体状凝胶。结合实验室前期研究结果，甲壳素溶液静置反应48～72h即可获得水溶性较好的半脱乙酰水溶性壳聚糖，也就是当甲壳素溶液粘度降低至原溶液粘度的1/2左右时，终止反应即可获得水溶性产物，这为大规模生产水溶性壳聚糖时快速判断反应终点提供依据。

3 结论

冻融循环处理能够显著破坏甲壳素分子内、分子间强氢键相互作用，破坏甲壳素高度规整的分子结构，使其结晶度下降，进而溶解于一定浓度的NaOH溶液中。甲壳素与一定量的40%NaOH混合物－18℃下冻融3次，能够在10%NaOH溶液中几乎完全溶解，而且NaOH的用量大大降低。经过两次冻融处理的样品形成的均相溶液，在25℃放置在84h以内进行缓慢的降解和脱乙酰反应，之后随脱乙酰程度加剧，自由氨基含量增多，重新形成分子间氢键相互作用，溶液表观粘度迅速增大，最终形成凝胶状。放置48h左右，表观粘度下降为初始粘度的一半，具有良好的水溶性。结果表明，利用FTC过程中反复形成和生长的冰晶产生的机械力破坏作用，能够破坏甲壳素晶体结构，从而导致其溶解性增强。为制备既可溶于水又保留其原有特性的高活性水溶性甲壳素提供了可能。冻融循环对甲壳素凝聚态结构的影响有待进一步研究。

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Effects of freezing－thawing cyclic treatment on the solubility of chitin in alkaline solution

LIU Ting－guo1，2，LI Bin1，*，SONG Xue1，LU Zhi－min2，WANG Rui－xia2，WANG Xin2
(1.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China;2.Department of Chemistry and Food Science，Chizhou College，Chizhou 247100，China)

TS201.2

A

1002－0306(2010)08－0084－05

2009－08－28 *通讯联系人

刘廷国(1982－)，男，硕士，讲师，研究方向:农副产品深加工与应用。

国家“863”资助项目(2007AA10Z310);池州学院化学材料与工程省级实验中心建设项目。