恒温和变温培养对羊肚菌菌丝生长及菌核形成影响的比较研究

谢 放，张生香，陈京津，魏孔丽，朱子雄

(兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃兰州730070)

恒温和变温培养对羊肚菌菌丝生长及菌核形成影响的比较研究

谢 放，张生香，陈京津，魏孔丽，朱子雄

(兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃兰州730070)

为了探究恒温和变温培养对羊肚菌菌丝生长和菌核形成的影响，设置－9℃ ～30℃的7个恒温处理，3个变温处理，通过观察和记录在两种不同培养方式下菌丝的长势、生长速度、菌落干重、产核时间、菌核数量等内容，从而比较出恒温和变温培养对羊肚菌菌丝生长和菌核形成的影响效果。结果表明，在恒温条件下羊肚菌菌丝生长和菌核发育比变温好，20℃最适宜菌丝生长，菌丝生长速度较快，菌落干重最大;25℃最适宜菌核生长发育，产核最早，菌核数量最多。

羊肚菌;恒温;变温;菌丝;菌核

羊肚菌(Morchella esculenta)是一种野生名贵食药用真菌，常于春末夏初发生，因含高蛋白、低脂肪、富含氨基酸和维生素，营养丰富、味道鲜美而深受人们欢迎［1］。羊肚菌菌丝的营养生长和菌核的形成及其生长发育是其生活史的重要阶段，也是子实体产生与否的关键［2，12］，其中温度是羊肚菌营养生长阶段的关键因子，目前有关温度影响羊肚菌菌丝生长和菌核发育报道的很多［3－6，10］，但是关于变温影响羊肚菌菌丝生长及菌核发育的研究在国内未见报道，因此，比较恒温和变温培养对羊肚菌菌丝生长及菌核发育的研究，进一步确定两种培养方式的优劣无疑具有重要的意义，为羊肚菌的基础理论研究提供科学理论知识，进而为实现羊肚菌子实体的商业化批量生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

羊肚菌(Morchella esculenta)采集于甘南州迭部县。

1.2 主要仪器

恒温培养箱，超净工作台，高压灭菌锅，DF205型电热鼓风干燥箱，电子天平等。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基 试验采用PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖 20 g、琼脂 20 g、水 1 000 mL，pH 自然。

1.3.2 菌种制备 将已培养好的斜面菌种，接种于9 cm的PDA平板上，25℃培养3～4 d，然后用已灭过菌的6mm打孔器切下长好的菌丝体块并转接于固体PDA平板培养基上。

1.3.3 不同温度试验 按常规方法，将菌种接种在PDA平板上，然后分7个处理，分别于－9℃、2℃、8℃、12℃、15℃、20℃、25℃、30℃恒温培养，观察菌丝和菌核生长情况，测量菌落干重。

1.3.4 变温试验 接种方法与上述同，分3个不同温度区间，二段式变温，低温区12℃，高温区15℃(12～15℃)、低温区15℃，高温区20℃(15～20℃)、低温区20℃，高温区25℃(20～25℃，培养时间为低温区和高温区各12 h。

1.3.5 菌丝体培养特征观察 每隔24 h，观察并记录菌丝长势，气生菌丝密度，当菌丝体培养到第4天(96h)时，以菌丝将近长满而未长满平皿时作为测量终点，以接种块为中心用刻度尺测量菌落直径(mm)，随机测量3次，取平均值。菌丝日均长速计算方法［7］：

最后取3个重复的平均值。

1.3.6 菌核培养特征观察 每隔24 h观察菌核是否形成，记录形成菌核时间，培养到30 d时，观察记录菌核分布和颜色特征，统计每个培养皿中形成的菌核数量［8］。

1.3.7 菌落干重测定 菌丝体培养到第5天时，将菌丝体连同培养基一同放入盛有蒸馏水的烧杯中，每个平板对应一个烧杯，然后将烧杯在微波炉中加热，直至培养基完全熔化，用玻璃棒挑出菌丝，置于滤纸上吸收多余的水分后，于DF205型电热鼓风干燥箱中105℃烘至恒重后称重，设置3个重复［7］。

2 结果与分析

2.1 不同温度及变温培养对羊肚菌菌丝体生长的影响

试验结果表明(见表1)，不同温度恒温和变温培养对菌丝生长具有差异显著，羊肚菌菌丝在－9℃不能生长，而在2～30℃之间，菌丝均能生长，但菌丝生长速度、长势、气生菌丝密度、菌丝形态和菌落干重都存在很大差异，具体分析如下：

2.1.1 不同温度对菌丝生长速度和长势的影响

由表1试验数据可知，羊肚菌菌丝在2～25℃之间生长速度与温度之间成正比关系，日均长速随温度升高而加快，25℃生长速度达到顶峰，达10.064 mm/d;菌丝长势也随着温度升高而旺盛，气生菌丝密度随温度升高而更加稠密，25℃是菌丝长势最好、气生菌丝密度最稠密的温度条件，当温度大于25℃时，菌丝生长速度下降、菌丝长势和气生菌丝密度均减弱、说明过高温度会加速菌丝老化，容易发黄。

2.1.2 不同温度对菌落干重的影响 从表1的试验数据来看，同样，菌落干重与温度也具一定的相关性，在2～20℃菌落干重随温度升高而随之增加，而且20℃菌落干重达到了顶峰，为211.8 mg，温度大于20℃时，菌落干重随温度呈直线式下降，在30℃时菌落干重仅仅40.83 mg。

2.1.3 不同温度下菌丝形态观察 由表1可知，在不同温度培养下菌丝形态也存在差异，有直立生长的，有铺在培养基表面绒絮状或毡戎状的，也有丝状辐射生长的，但是菌丝形态随着温度升高总的趋势是：在温度低于15℃条件下菌丝铺在培养基表面生长，随着温度升高菌丝密度逐渐增加，进而形成绒絮状或毡戎状的菌丝形态。

2.1.4 恒温和变温对菌丝生长影响的比较 根据表1恒温和变温两种培养方式下的试验结果可以看出，15℃以上条件下，菌丝的长势、生长速度以及气生菌丝密度等变温培养均不及恒温培养好，说明恒温条件下，菌丝生长稳定，体内酶系统受到的干扰少，而变温会引起生物的应急反应，干扰菌丝体细胞内酶促反应的稳定，由此表现出代谢降低、生长速度减慢。只有12℃ ～15℃温度范围条件下，升温对生长的促进的作用大于变温对生长的干扰作用。

表1 不同温度恒温与变温培养对羊肚菌菌丝生长的影响

2.2 不同温度及变温培养对羊肚菌菌核生长发育的影响

表2研究结果表明，羊肚菌在－9℃、30℃条件下不产生菌核，在2～25℃范围内均能产生菌核，而且菌核形状一致，均为球状，但在菌核分布、产核时间、菌核数量、颜色上均存在明显差异。

2.2.1 不同温度对产核时间和菌核数量的影响

从表2试验结果来看，15℃、20℃、25℃同一天产核，产核最早，第10天产核，而且在25℃下产生的菌核数量最多，平均达到132个，而2℃产核最晚，第20天才产核，菌核数量最少，平均仅产生了4个，而且不能成熟。30℃不产核，这是由于偏高的温度下菌株的长势差，后期迅速老化，故不易产核。由此可知，产核时间与温度相关不大，但是菌核数量与温度有直接的关系，25℃产核数量最多，表明25℃是产生菌核的最佳温度。

表2 不同温度恒温与变温培养对羊肚菌菌核形成及生长发育影响

2.2.2 不同温度对菌核分布、大小和颜色的影响

由表2可知，菌核分布呈现随机性，有分散分布、培养皿边缘分布、培养皿边缘密集分布等形式，但菌核大小、数量和颜色与温度直接相关，随着温度升高，数量增加，单个菌核体积增加，颜色由白色加深至黄褐色，2℃、8℃培养虽然能产生菌核，但是菌核颜色一直呈白色，说明低于8℃温度下产生的菌核发育不成熟。这与李素玲等［2］报道一致，菌核发育成熟的变化过程表现为：针尖大的幼菌核由淡黄色→中心杏黄、四周淡黄色→棕色→深棕色→污棕色的老龄菌核团(堆)。

2.2.3 恒温和变温对菌核生长发育影响的比较

根据表2恒温和变温两种培养方式下的试验结果来看，变温培养不利于菌核的生长发育，产核时间、菌核大小和数目均不及恒温培养好。从产核时间、菌核大小和颜色比较来看，变温区培养的菌核质量不如恒温好，变温比恒温培养产核时间推迟5～11天，菌核数量显著减少。

3 讨论

3.1 关于最适宜的温度范围问题

在菌丝和菌核生长发育的最适宜温度范围方面，前人已经有所报道，但是本试验结论与前人的研究结果略显差异，第一，在适宜菌丝体生长温度方面，陈易飞等报道羊肚菌菌丝体在2～34℃之间均能生长，其中24～26℃为最适生长温度，34.5℃为致死温度［4］，本试验研究发现，羊肚菌菌丝在2～30℃范围内均能生长，其中15～25℃是菌丝最适生长温度;第二，在适宜菌核发育温度方面，刘兴蓉，陈芳草等研究结果：羊肚菌在5～30℃范围内均能产生菌核，而菌株A的最佳产核温度范围为15～20℃之间，菌株B在5～30℃的较宽温度范围内产核［9］，本试验研究结果为羊肚菌在2～25℃温度范围内均能产核，20～25℃是最佳产核范围;第三，变温对菌核生长发育的影响，结果发现，菌种在恒温条件下产核时间、菌核数量、大小、菌核成熟度均比变温处理的好，本结果跟刘兴蓉等(2004)羊肚菌产核条件的研究结果一致，作者认为菌株A、菌株B在恒温条件下菌核长势、数量以及产核时间均比变温处理好［10］。可见，菌丝生长和菌核发育的最适温度范围存在差异，主要是由于菌株来源和遗传背景不同，同时也反映了羊肚菌生理特性的多样性［11］。

3.2 关于恒温和变温的影响

羊肚菌在自然界全是变温的环境，没有恒温条件，菌丝和菌核的生长发育应该完全适应变温条件，但本实验得到的结果是恒温比变温好，其原因如下：第一，自然界的变温是一个缓慢的过程，菌丝细胞内的酶系统能够适应缓慢变化的环境条件，而在实验室条件下温度突然升高或降低，使菌丝和菌核不能很好适应温度的剧烈式变化，使其细胞代谢发生紊乱，从而影响了菌丝和菌核的生长发育;第二，变温范围与时段的设置可能不够合理，本试验只是一个小范围的变温，自然界的变温区间大，所以，如果变温时段与温差范围进行模拟自然环境设置，是否会有另外结果，需要今后继续研究。

3.3 关于最佳温度问题

前人在研究关于菌丝生长和菌核发育最佳温度方面，只是限于单方面因素，把菌丝长速最快，菌落干重最大，产核时间最早，数量最多分开考虑，从而得出菌丝生长和菌核发育的最佳温度，但是本试验研究发现，菌丝生长速度快不一定菌落干重大，25℃菌丝生长速度最快，但是其菌落干重小于20℃的菌落干重，其原因是生长速度快，菌丝体内积累的营养物质少，所以25℃的菌落干重不及20℃的菌落干重。这个现象或许在食用菌或者在羊肚菌袋料栽培中是一个很好的操作依据，应该把菌丝生长速度最快，菌落干重最大，产核时间最早，菌核数量最多结合考虑，从而设置相应的温度，根据本试验结论，在食用菌或者羊肚菌袋料栽培中，菌丝生长阶段将温度设置为菌丝最适的温度，使其快速吃料，以免污染，然后将温度降低到最适温度以下，降低菌丝生长速度，使其在体内积累更多的营养物质，这样培养出来的子实体或许质量更好。

4 小结

(1)菌丝生长和菌核发育的最适宜温度范围分别为：15～25℃和20～25℃。

(2)25℃菌丝生长速度比20℃略高一点，但是20℃菌落干重远远超过25℃的菌落干重，所以20℃是羊肚菌菌丝营养生长阶段的最佳温度。

(3)15℃、20℃、25℃同一天产核，但是25℃菌核数量最多，因此25℃是羊肚菌菌核形成及生长发育的最佳温度。

(4)在恒温和变温培养方面，在15℃以上的相同温度范围内，恒温比变温培养好。

［1］ 侯集瑞，李 玉，图力吉尔，等.赤霉素和α－萘乙酸对羊肚菌菌丝生长的影响［J］.吉林农业大学学报，2001，23(4)：41－43.

［2］ 李素玲，尚春树，施安融，等.羊肚菌菌丝体生长特性及菌核培养特征的初步观察［J］.山西农业科学，1998，26(2)：72 －75.

［3］ 李 洁，张云霞，邱德江.不同因素对羊肚菌孢子萌发和菌丝生长的影响［J］.河北林业科技，2004(2)：1－2.

［4］ 张 松，胡虾妹，谢海燕.尖顶羊肚菌液体培养基质与条件的研究［J］. 菌物研究，2004，2(4)：11－15.

［5］ 杨 芳，王新风，朱 骏，等.肋脉羊肚菌液体培养条件的研究［J］.食品科学，2008，29(2)：280 －282.

［6］ 欧 超，王 娣，张兆轩，等.羊肚菌液体深层发酵条件［J］.食品与生物技术学报，2007，26(2)：80 －84.

［7］ 董 雪.黑麦羊肚菌生物学特性研究［D］.北京师范大学硕士研究生论文，2004：38 －39.

［8］ 郑 磊，程显好，王淑芳.五种碳源对核盘菌丝生长及菌核形成的影响［J］.安徽农业科学，2008，36(4)：1366－1367.

［9］ 陈易飞，郭益红.温度、PH对羊肚菌菌丝体生长的影响［J］.现代农业与新农村建设，1998，21(5)：28 －29.

［10］ 刘兴蓉，陈芳草，谭方河，等.羊肚菌产核条件研究［J］.四川林业科技，2004，25(3)：44 －46.

［11］ 彭 璐，常继东.羊肚菌菌丝体培养特性的研究［J］.食用菌，2006(5)：10 －12.

［12］ 任桂梅，张少刚.羊肚菌的研究进展［J］.延安大学学报，1999，18(1)：58 －59.

Effects of Constant and Variable Temperature Cultivation on the Mycelium Growth and Sclerotia Formation of Morchella esculenta

Xie Fang，Zhang Shengxiang，Chen Jingjing，Wei Kongli，Zhu Zixiong
(College of Chemical and Biological Engineering Lanzhou Jiao Tong University，Lanzhou 730070，China)

In order to explore the effects of constant temperature and variable－temperature cultivation on the mycelial growth and sclerotium formation of Morchella esculenta，set－9℃ to 30℃ 7 constant temperature treatments and three variable－temperature treatments by observing and recording the growth rate of myclium，dry weight of colony，the production of sclerotium time，the number of sclerotia and other content at the two different of cultivation modes to compare the outcome of effect of constant temperature and variable－temperature cultivation on the mycelial growth and sclerotium formation.The results show that in the constant temperature conditions，the growth of mycelium and sclerotium formation better than the variable temperature，20℃ is the best for mycelial growth，the growth faster of mycelial and the largest dry weight of colony;25℃ is best for sclerotium growth，the earliest production of sclerotium，the largest number of sclerotia.

Morchella;constant temperature;variable temperature;mycelium;sclerotium

Q935

A

1006－9690(2010)03－0037－04

10.3969/j.issn.1006－ 9690.2010.03.009

2009－11－10

谢放(1962－)，男，甘肃兰州人，博士，硕士生导师，研究方向：资源与环境微生物学