羧甲基壳聚糖的制备及其在保鲜中的应用

朱昌玲，史劲松，孙达峰，张 和，戚善龙

(1.南京野生植物研究院，江苏南京210042;2.扬州日兴生物科技股份有限公司，江苏扬州225001)

羧甲基壳聚糖的制备及其在保鲜中的应用

朱昌玲1，史劲松1，孙达峰1，张 和2，戚善龙2

(1.南京野生植物研究院，江苏南京210042;2.扬州日兴生物科技股份有限公司，江苏扬州225001)

研究了在碱性条件，无溶剂体系下壳聚糖羧甲基化制备工艺，通过IR对反应前后壳聚糖结构进行了表征。最佳反应条件：2 g壳聚糖，在NaOH加入量为5 g、碱化时间为6h、氯乙酸用量为6g、3%KI、反应时间为8 h、反应温度60℃，产品取代度为1.27。同时研究了羧甲基壳聚糖对辣椒、猪肉涂膜保鲜实验，结果显示对辣椒、猪肉具有较好的涂膜保鲜作用。

壳聚糖;羧甲基化反应;保鲜

壳聚糖(Chitosan，Cts)是甲壳素脱乙酰后的产物，是一种天然碱性多糖，由于只能溶解于酸及酸性水溶液中，限制了它的理论研究及生产应用。但壳聚糖具有优良的生物亲和性和生物可降解性，容易制成各种衍生物［1］。在众多衍生物中羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl－chitosan，CMC)研究最早，也最引人注目。羧甲基壳聚糖是将羧甲基引入壳聚糖而得到的一类壳聚糖衍生物，通过羧甲基改性，可以破坏壳聚糖分子间的氢键，增加其水溶性。使其既能溶于酸中，又能溶于碱中，成为聚两性电解质，从而大大扩大了壳聚糖的应用范围［2］。由于CMC的水溶性比甲壳素和壳聚糖好，从而得到更好的发挥功效，可用作化妆品的保湿剂、果蔬保鲜剂、植物生长促进剂、水处理絮凝剂及多种药物辅剂等［3］。

根据文献［4－10］报道，在制备羧甲基壳聚糖时，均需加入异丙醇、1，4－二氧六环、二甲亚砜(DMSO)等其中一种有机溶剂进行膨化，生产时也不利于乙醇的回收利用。本文对其制备工艺及条件加以改进，在不加膨化剂的基础上对制备条件进行了研究，优化出了最佳制备条件。

由于壳聚糖只能溶解于酸和酸性水溶液中，酸性水溶液损伤了果蔬表层，在很大程度上限制了它在果蔬涂膜保鲜上的应用。羧甲基壳聚糖溶于水，在水溶液中容易形成牢固的膜，此膜对气体有选择渗透性，特别适于果蔬保鲜［11］，现将制备的产品对辣椒进行保鲜实验。另外根据其抑菌作用，也进行了猪肉保鲜探索，以期能为羧甲基壳聚糖应用于果蔬、肉食保鲜提供一定的基础资料依据。

1 材料与方法

1.2 仪器与试剂

仪器：离心机、磁力搅拌器、真空干燥箱、烘箱、PB－10型酸度计、NDJ－1旋转式粘度计、水浴加热器等;Nicolet670傅立叶变换红外光谱仪，KBr压片，扫描范围为4 000～400 cm－1，扫描次数为32次，分辨率为4 cm－1。

壳聚糖：由扬州日兴生物科技股份有限公司提供，食品级、脱乙酰度≥90%;

辣椒：市场购买，没有机械损伤、没有病虫害、个头较大、均匀厚实硬朗的新鲜辣椒;

猪肉：市场购买新鲜猪肉;

实验所用试剂均为分析纯;乙醇为95%、食品级。

1.3 方法

1.3.1 测定方法

1.3.1.1 羧甲基壳聚糖取代度的测定［4］

精确称取0.5 g干燥至恒重的羧甲基壳聚糖于250 mL容量瓶中，精确移取50 mL 0.1 mol/L盐酸标准溶液于其中，振摇，使完全溶解，用0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，同时用pH计测pH值。

取代度的计算公式如下：

式中：A—每克样品中羧甲基的物质的量，mmol;

V1—pH值为2.1时滴定所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL;

V2—pH值为4.3时滴定所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL;

W—样品净重，g;

M—氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L。

1.3.1.2 辣椒失重率的测定

每次任意取出每组中的一只，称取辣椒的重量。

式中：m0—第1天辣椒的质量;

mn—第N天辣椒的质量。

1.3.1.3 辣椒硬度的观察

物理观察法，用肉眼观察辣椒的变化后进行描述记录。

1.3.1.4 猪肉感官指标

无异味，无酸败味。

1.3.2 实验方法

1.3.2.1 羧甲基壳聚糖的制备

称取2 g壳聚糖于三角瓶中，缓慢加入一定体积的40%NaOH溶液，搅匀，在常温下进行碱化。加入催化剂。称取一定量的氯乙酸，分3次投入已碱化的溶液中，每次间隔10 min，然后加热进行反应。反应结束后加入一定量的蒸馏水，冷却至室温，用冰乙酸调节溶液pH值至7。将溶液在4000 r/min下，离心15 min，取其上清液。在搅拌状态下，将上清液缓慢加入到150 mL 95%乙醇中，静置2 h，抽滤除去溶剂，用70%左右的乙醇洗涤3次，在60℃下真空烘干，粉碎即得灰白色粉状羧甲基壳聚糖成品。

1.3.2.2 羧甲基壳聚糖的涂膜保鲜实验

(1)辣椒保鲜

将辣椒用清水清洗，自然凉干。随机分成2组，每组6只。第一组：水洗处理，作为对照;另一组：用加一定量的甘油等，配制成的2%羧甲基壳聚糖溶液进行涂膜处理。

分别放入溶液中浸泡1 min，取出晾干，置于室温下(实验在夏季，室温25～30℃)并在塑料薄膜中贮藏。每隔两天进行测一次理化指标。

(2)猪肉保鲜

将猪肉在自来水下反复冲洗干净后，用75%酒精擦拭刀具和案板，切成约50 g/块，分别在下列几组实验液中浸泡2 min，取出沥干后装在聚苯乙烯泡沫托盘中，用低密度聚乙烯保鲜薄膜加以覆盖，贮存在(3±1)℃冰箱中，每隔2 d测定其指标。

实验分组为：Ⅰ、对照组，用无菌蒸馏水;Ⅱ、pH为4.5醋酸缓冲液溶液;Ⅲ、1.0%羧甲基壳聚糖;Ⅳ、用pH为4.5醋酸缓冲液溶液，配制的1.0%羧甲基壳聚糖。

2 结果与讨论

2.1 羧甲基壳聚糖的制备条件的优化

2.1.1 催化剂对羧甲基化反应的影响

固定其它反应条件，根据文献报道，选择了3种催化剂，对其催化作用进行比较。结果如表1：

表1 催化剂对羧甲基化反应的影响

从表1中看出，KI的催化作用相当明显。因为KI与C1CH2COONa反应生成ICH2COONa，由于I－的离去能力大于Cl－，因此ICH2COONa更容易与壳聚糖反应，生成羧甲基壳聚糖，但催化剂量继续增加，ICH2COONa水解副反应也会增强。

2.1.2 碱化时间对产品的影响

在氯乙酸用量为4 g，反应时间为5 h，反应温度60℃时，改变壳聚糖的碱化时间，对所得产品的取代度影响进行研究，结果如图1所示：

图1 碱化时间对产品取代度的影响

从图1得知，随着壳聚糖碱化时间的延长，产品取代度增大，水溶性逐渐变好，但4 h后增加不明显，所以取6h为最佳碱化时间。

另外，通过实验得知，羧甲基壳聚糖取代度在0.5以上时，即可全部水溶。

2.1.3 氯乙酸用量比对产品的影响

在碱化时间为6h，反应温度60℃，反应时间为5 h时，改变氯乙酸用量，对产品的取代度影响见图2所示：

图2 氯乙酸用量对产品取代度的影响

取代度随氯乙酸用量的增加而增加，水溶性也随着变好，但当氯乙酸用量增加到一定程度时，取代度增大变缓。因为羧甲基化反应主要包括两种反应：一是氯乙酸与碱的中和及水解反应(副反应);二是氯乙酸钠与碱化CTS的反应。氯乙酸用量增加，发生羧甲基化反应的几率增加，导致DS上升，但当氯乙酸用量继续增加时，过量氯乙酸中和了部分NaOH，不利于羧甲基化反应。由此可见，氯乙酸较适宜的用量为6g。

另外，羧甲基化反应是一个放热反应，如果操作过程中将氯乙酸一次加入，反应十分激烈，很难控制其反应温度，而且氯乙酸利用率降低。为此，采用分次加入氯乙酸的方法，可有效的提高反应效率。

2.1.4 碱用量对取代度的影响

在浸泡时间为6h，氯乙酸用量为6g，反应温度60℃，反应时间5 h时，改变氢氧化钠用量，对产物取代度影响结果见图3：

图3 氢氧化钠用量对羧甲基化反应的影响

由图可见，随着氢氧化钠用量的增加，羧甲基壳聚糖的取代度均呈递增趋势，但是碱用量过大时，取代度反而下降了。因为羧甲基化反应是在碱性环境下进行的，反应体系中碱量的增大，有利于壳聚糖结构单元中更多活性中心形成，产物取代度相应提高。同时也会提高副反应的发生率，降低氯乙酸的利用率。当氢氧化钠用量为5 g时，取代度达到最大。

另外，实验中得知碱量的增加对产品的粘度和色泽没有显著的影响。

2.1.5 反应时间对羧甲基化反应的影响

在确定氢氧化钠用量为5 g，加入3%KI，其他反应条件不变的情况下，考察反应时间对反应产物取代度的影响，结果见图4。

图4 反应时间对羧甲基化反应的影响

随反应时间的延长，取代度呈递增趋势，当反应8 h后此趋势变化缓慢，因此取最佳反应时间为8 h。

2.1.6 反应温度对取代度的影响

在反应时间为8 h，其他反应条件不变，研究反应温度的变化对产物取代度的影响，结果见图5。

图5 反应温度对羧甲基化反应的影响

由图5可知，升高反应温度有利于壳聚糖的羧甲基化，当温度升高至60℃时，所得产品的取代度达到最高，超过此温度产品的取代度反而下降。因为反应温度的升高使活性中心发生羧甲基反应的几率提高，进而取代度有所提高，但温度高于60℃时，氯乙酸的水解加快，使氯乙酸利用率低不利于取代反应的进行。

2.2 IR分析

图6 壳聚糖的红外谱图

图7 羧甲基壳聚糖的红外谱图

从图中可以看出，在羧甲基壳聚糖中1 602.7 cm－1、1 424.51 cm－1处出现了羧基钠盐的特征峰，分别为—COONa不对称和对称伸缩振动吸收峰。在壳聚糖中 1 597.7 cm－1、1 654.62 cm－1为—NH2的变形振动双峰，在羧甲基壳聚糖中变成单峰，是氨基发生羧甲基化的标志。再则，在壳聚糖中的3 449.48 cm－1处的宽峰是—OH、—NH2的伸缩振动峰，取代后峰变弱，说明—OH、—NH2被取代。另外图7中还存在1 054.29 cm－1处的C—O—C基团的吸收峰，这是羧甲基壳聚糖的特征峰，进一步说明壳聚糖发生了羧甲基化反应。

2.3 羧甲基壳聚糖的涂膜保鲜实验结果

2.3.1 辣椒保鲜

2.3.1.1 辣椒涂膜处理后对外观的影响

表2 涂膜处理对辣椒外观的影响

从表2可以看出，辣椒进行羧甲基壳聚糖涂膜处理后，外观情况明显改观。因为经羧甲基壳聚糖溶液涂膜后，能在其表面现成一层均匀的半透明薄膜，从而使果实在特定的“小气候”环境下保存。另外其溶液有一定的抑菌作用。

2.3.1.2 涂膜处理后对辣椒失重率的影响

表3 涂膜处理对辣椒失重率的影响

表3说明，辣椒进行羧甲基壳聚糖溶液涂膜处理后，失重也明显改善。水是维持细胞正常机能，保持果蔬新鲜的必要条件，失水是造成果蔬细胞生理功能降低，有害物质增多，最终导致结构破坏的主要原因。

2.3.2 猪肉保鲜

表4 猪肉的感官测定

从表4看出，醋酸缓冲液处理对猪肉保鲜有一定作用，但其效果明显低于羧甲基壳聚糖。与醋酸缓冲液的低pH酸抑制微生物生长的机制不同，羧甲基壳聚糖的保鲜作用在于其成膜性和抑菌特性，达到保鲜目的。醋酸缓冲液、羧甲基壳聚糖进行综合利用，效果更佳。

用pH为4.5醋酸缓冲液溶液，配制的1.0%羧甲基壳聚糖对新鲜猪肉进行涂膜处理，猪肉在(3±1)℃贮藏条件下，其腐败时间可以延长12 d。

3 结论

(1)在制备羧甲基壳聚糖时，不加入异丙醇、1，4－二氧六环、二甲亚砜(DMSO)等其中一种有机溶剂进行膨化，同样可以得到取代度较高的产品。2 g壳聚糖，在NaOH加入量为5 g、碱化时间为6h、氯乙酸用量为6g、3%KI、反应时间为8 h、反应温度60℃，所得产品的取代度最高为1.27;

(2)通过IR分析，说明壳聚糖发生了羧化反应;

(3)用羧甲基壳聚糖分别对辣椒、猪肉进行涂膜保鲜实验，通过对辣椒外观、失重率的测试比较，证明其对辣椒有很好的涂膜保鲜作用;通过对猪肉的感官测定比较，证明其对猪肉有很好的涂膜保鲜作用。

［1］ 李世迁，姚评佳，魏远安，等.羧甲基壳聚糖季胺盐的制备及其抗菌性能研究［J］.化学与生物工程，2006(11)：22－24.

［2］ 陈鲁生，李嘉霖.O－羧甲基壳聚糖制备条件的研究［J］.山东师大学报：自然科学版，1999，(1) ：22－24.42－43.

［3］ 王卫东，许时婴.羧甲基壳聚糖的制备及其在黑莓果汁澄清中的应用［J］.工艺技术食品科学，2008(3)：241－244.

［4］ 李小飞，吴玉英.羧甲基壳聚糖的制备［J］.精细与专用化学品，2006(24)：26－29.

［5］ 郑 蕾.非质子溶剂法制备羧甲基壳聚糖［J］.安徽工程科技学院学报，2007(2)：22－25.

［6］ 吴友吉，宋庆平，李庆海.高取代度羧甲基壳聚糖的制备糖［J］.合成化学，2006(5)：506－509.

［7］ 王卫东，许时婴.羧甲基壳聚糖的制备及其在黑莓果汁澄清中的应用［J］.食品科学，2008(3)：241－244.

［8］ 纪淑娟，高 倩.羧甲基壳聚糖的制备及其在黄瓜保鲜中的应用研究［J］.食品工业科技，2008(2)：201－203.

［9］ 李万海，程艳洁，齐爱玖，等.羧甲基壳聚糖的制备及应用［J］.吉林化工学院学报，2008(1)：7－10.

［10］ 蒋挺大.甲壳素［M］.北京：化学工业出版社，2003：301－302.

［11］ 连玉晶，赵海田，姚 磊，等.羧甲基壳聚糖可食用膜对保鲜油豆角化学成分的影响［J］.食品科技，2005(12)：77－79.

Study on Preparation of Carboxymethyl Chitosan and its Application to the Preservation

Zhu Changling1，Shi Jingsong1，Sun Dafeng1，Zhang He2，Qi Shanlong2
(1.Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plant，Nanjing 210042，China;2.Ltd.Yangzhou Rixing Biotechnology Co.，Yangzhou 225001，China)

Carboxymethyl chitosan was synthesized at basic pH without solvent.The molecular conformation of modified chitosan was characterized by FTIR before and after the reaction.The optimum reaction conditions were as follows： alkalization time 6h;mass ratio of chloroacetic acid to chitosan 3∶1;NaOH 2.5∶1;3%KI，reaction temperature 60℃;reaction time 8 h.Carboxymethyl chitosan was obtented with a degree of substitution over 1.27.Further experiment results proved that carboxymethyl chitosan prepared had a very good preservation on film coating antistaling.

Chitosan;Carboxymethytlation;Preservation

O636.1

A

1006－9690(2010)03－0041－05

10.3969/j.issn.1006－ 9690.2010.03.010

2009－09－15

江苏省科技成果转化专项资金项目(BA2009103)。