阿德福韦联合特异性树突细胞疫苗治疗慢性乙型肝炎抗病毒疗效与Th细胞因子观察

郭力红 张岁 刘静 李保欣 段卫 佟立新

慢性乙型肝炎(CHB)由于病毒持续复制及免疫功能紊乱使肝细胞不断受损害，最终发展为肝硬化或肝癌。阿德福韦酯(adefovir dipivoxil，ADV)是通过竞争脱氧腺苷三磷酸底物，使乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)链终止而抑制病毒的复制［1］。CHB患者体内乙型肝炎病毒(HBV)持续存在不易清除的原因可能是机体免疫力低下，对感染的HBV形成免疫耐受所致［2］。患者免疫功能缺陷的重要原因之一是其外周血中树突细胞(dendritic cell，DC)数量下降，表型不成熟，功能降低，无法有效呈递HBV抗原肽，不能诱发有效的特异的体液免疫和细胞免疫应答，从而不能激活DC的抗原呈递功能及IFN等Th1型因子的分泌，导致CHB患者Th1/Th2细胞间的失衡［3］。树突状细胞作为最强大的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APC)，是体内唯一具有激活幼稚T淋巴细胞(native T lymphocyte)诱导初次免疫应答能力的APC，Th1/Th2的平衡在HBV感染人体后病情发展方向中起到决定作用，Th1细胞主要产生白介素2(IL-2)、IFN-γ等细胞因子，而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-10等细胞因子，故观察血清IFN-γ、IL-4细胞因子，研究HBV感染时Th1/Th2状态对认识乙型肝炎发病、发展、预后和观察治疗效果均有积极意义。本文通过观察CHB患者在应用ADV联合特异性树突细胞疫苗治疗过程中，分析治疗后抗病毒疗效及Th细胞因子的变化，为联合治疗慢性乙肝提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2006年10月至2009年10月我肝病中心门诊或住院慢性乙型肝炎患者32例，男28例，女4例;年龄18～64岁，平均年龄(36±11)岁。所有患者丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)均＞40 U/L，HBV-DNA均＞5.03log10。入选患者无其他病毒合并感染及严重并发症，治疗前6个月内未使用过任何抗病毒及调节机体免疫的药物，全部获得知情同意。诊断标准符合2000年修订的“病毒性肝炎防治方案”［4］及2005年“慢性乙型肝炎防治指南”。

1.2 主要试剂与仪器 DC疫苗制备试剂:重组人粒-巨嗜细胞集落细胞刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4(rhIL-4)、1640培养液、鼠抗人CD40、CD83，购于河北博海生物工程有限公司，HBsAg购于中国预防医学科学院病毒所。酶联免疫吸附测定试剂:IL-4、IFN-γ抗体酶联免疫检测试剂盒均购于河北生物工程有限公司。仪器:二氧化碳(CO2)培养箱(Thermo Forma，美国)，倒置显微镜(Olympus，日本)，可在450 nm处进行计数的全自动酶标仪(Thermo，芬兰)，37℃恒温箱(SBHW-IV，北京)，可调多道移液器及枪头(EPPENDORF，德国)，离心机(LD-25-2，北京)，振荡混匀器(XW-80A，上海)。

1.3 方法 在无菌条件下抽取受试者外周静脉血20 m l，肝素抗凝，在百级试验室进行下面操作:0.9%氯化钠溶液1∶1稀释抗凝血，层加到淋巴细胞分离液2 000 r/min离心30 min，分离出外周血单核细胞并计数，用1640培养液洗2次，在加入含有体积分数150 ml人AB型血清的1640培养液完全培养基重悬细胞，以2×109/L的细胞浓度加入一次性6孔培养板中，于37℃ 50 ml/L CO2饱和湿度下培养4 h，吸弃上清液，再用1640培养液轻洗2次，除去非贴壁细胞，加入含8 335μkat/L rhGMCSF和8 335μkat/L rhIL-4的完全培养基，隔日换液，培养至第6天再加入终浓度为2.5 mg/L的HBsAg，4 h后加入终浓度为10μg/L的 TNF，继续在37℃ 50 ml/L CO2饱和湿度下培养1 d，收获DC用0.9%氯化钠溶液洗涤2次并计数，即刻在受试者腋下部位常规消毒后经皮下注入体内。同时取细胞洗液做无菌实验。回输2次为1个疗程(间隔周)，共治疗3个疗程。1.4 检测指标 留取患者治疗前及治疗过程中的血清，冻存于-86℃冰箱，分别检测治疗前及治疗过程中各项指标。

1.5统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性乙肝患者肝功能、HBV-DNA在治疗过程中的变化ALT和AST从治疗4周末有明显改善(P＜0.05)，AST到12周末达正常范围，ALT到48周末达正常范围。HBV-DNA从治疗12周末起即有明显改善(P＜0.05)，在治疗12周末、24周末改善值明显升高(P＜0.05)，在48周末病毒阴转。见表1。

2.2 IFN-γ、IL-4在治疗过程中的变化 IFN-γ水平在12周末、24周末明显高于治疗前(P＜0.05)，IL-4水平在12周末、24周末明显低于治疗前(P＜0.05)。见表2。

表1 治疗前后肝功能ALT、AST、HBV-DNA变化n=32，±s

表1 治疗前后肝功能ALT、AST、HBV-DNA变化n=32，±s

注:与治疗前比较，*P＜0.05

指标 治疗前 治疗4周 治疗12周 治疗24周 治疗48周ALT(U/L) 132±48 70±25* 48±15* 46±16* 35±10*AST(U/L) 85±23 70±25* 31±9* 28±7* 29±8*DNA(log10) 6.4±0.8 5.8±0.8 4.9±0.9* 3.9±0.7* 2.8±0.8*

表2 IFN-γ、IL-4在治疗前及治疗过程中的变化n=32，±s

表2 IFN-γ、IL-4在治疗前及治疗过程中的变化n=32，±s

注:与治疗前比较，*P＜0.05

指标 治疗前 治疗4周 治疗12周 治疗24周 治疗48周IFN-γ 39±9 39±9 55±12* 58±12*39±8 IL-4 371±45 377±50 287±48* 282±55*371±47

3 讨论

慢性乙型肝炎是严重危害我国人民健康的常见传染病，全球有约4亿人患CHB［5］，约30%的肝硬化和50%的肝细胞癌发病与之有关［6］，给个人、家庭和社会造成沉重负担。国内外对CHB治疗已有较大的进展，其中抗病毒治疗是最主要、最根本的措施［7］。

阿德福韦酯口服后经过体内非特异性酯酶水解，迅速转化为阿德福韦，阿德福韦是一种无环单磷酸脱氧腺苷类似物，被细胞内普遍存在的激酶磷酸化生产二磷酸阿德福韦。二磷酸阿德福韦和脱氧腺苷三磷酸(dATP)与多聚酶结合位点竞争性结合，从而抑制HBV-DNA，多聚酶、人免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶、对拉米夫定耐药的HBV-DNA多聚酶活性，还可与腺苷酸竞争性掺入病毒DNA链，终止DNA链合成以抑制病毒复制［8］。国外研究显示，ADV可有效抑制HBV复制，不仅对野生株有良好的抑制作用，对YMDD变异株也有明显抑制作用，持续降低HBeAg阳性和HBeAg阴性的YMDD变异患者血清HBV-DNA和ALT水平，使患者获得病毒学，肝脏生化功能和组织学的改善［9，10］。

DC是机体免疫应答的主要启动者，在免疫应答的诱导中发挥关键的作用。DC的主要作用是提呈抗原，而只有成熟的DC才具有提呈抗原的能力，DC的不成熟是导致免疫耐受的原因之一。研究发现，慢性乙型肝炎患者的树突状细胞存在成熟及功能异常，其功能缺陷将导致抗原无法被有效地提呈给CD+4辅助性T淋巴细胞(Th)，从而导致其激活特异性抗病毒免疫反应，特别是细胞免疫反应的能力低下［11］。通过体外特异性抗原刺激DC，进而活化细胞毒性T淋巴细胞可达杀伤HBV感染的宿主细胞的作用。辅助性T淋巴细胞是调节机体免疫反应的关键细胞，Th1主因分泌IFN-γ等细胞因子，引起细胞免疫应答，Th1细胞占优势，发生急性自限性感染和HBV清除。Th2则主因分泌IL-4等细胞因子，引起体液免疫应答，而Th2细胞占优势，发生持续的慢性HBV感染，持续Th2型细胞因子分泌不利于病毒的清除，HBV感染致Th1/Th2细胞失衡，从而使Th1主导的细胞免疫功能受到抑制［12］。IL-4和IFN-γ之间的平衡对于Th0分化为Th1或Th2起关键调控作用，外源性IL-4可使CD+4前体细胞向Th2效应细胞分化，而IFN-γ则对前体细胞向Th2分化过程起抑制作用［13］。有学者报道在CHB患者抗病毒治疗过程中，随着HBV-DNA水平的下降，伴有IL-4水平的下降和IFN-γ水平的增加［14］。DC有效地激发T细胞活化，为慢性乙型肝炎免疫治疗开辟了一条新途径。本研究发现HBV-DNA改善值从4周末改善，在12、24周末明显改善，IFN-γ水平在治疗12周末明显升高，在治疗24周末达高峰，提示IFN-γ水平上升速度与HBV-DNA病毒载量下降速度相关。IL-4水平在治疗过程中逐渐下降。在治疗中可检测到血清IFN-γ水平上升和IL-4水平下降，提示联合治疗可以促进更多的Th1型细胞因子分泌，以利机体抗HBV免疫的恢复或增强，为清除病毒创造条件。

本研究提示，ADV联合特异性树突细胞疫苗在治疗过程中，不仅能抑制乙肝病毒的复制，而且能调动机体的免疫反应，打破机体的免疫耐受，恢复T细胞功能。本文探讨了阿德福韦联合特异性树突细胞疫苗治疗过程中机体免疫细胞功能的动态变化，表明联合治疗可直接抑制HBV-DNA合成，还可作为免疫调节剂，一定程度上改善CHB患者细胞因子的功能活性。在CHB治疗过程中，细胞因子水平检测可以作为血清学应答的一项监测指标，并且细胞因子有望成为抗病毒治疗的手段［15］。通过细胞因子调节，使Th2向Th1偏移，有利于机体的免疫应答清除病毒，可作为设计治疗CHB的策略。

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