静电纺再生丝素蛋白改性研究进展

边瑞琦，熊 杰

(浙江理工大学 先进纺织材料与制备技术教育部重点实验室，杭州 310018)

静电纺再生丝素蛋白改性研究进展

边瑞琦，熊 杰

(浙江理工大学 先进纺织材料与制备技术教育部重点实验室，杭州 310018)

在明确了丝素蛋白作为一种生物相容性较好但力学性能较差的基础上，回顾了近年来国内外学者针对静电纺丝素蛋白改性方法研究，总结出通过物理、化学方法及装置的改变可以对静电纺丝素蛋白进行改性，且改性效果相当明显。提出以共混其他聚合物及制备形状特殊的纳米纤维等物理方法是对再生丝素蛋白纳米纤维支架比较有效的改性方法。

静电纺丝；丝素蛋白；组织工程支架；改性

丝素蛋白(SF)是一种资源丰富、性能优良的生物医用材料[1]，具有良好的生物相容性和可降解性，利用静电纺丝法制备再生丝素蛋白纳米纤维是一种很好的制备组织工程支架的方法[2]。

但由于丝素蛋白从蚕丝溶解液中经过脱胶提纯出来后，二级结构发生改变[3]，决定了丝素蛋白在机械性能方面存在某些缺陷。要解决这一问题，必须进行改性，使力学性能达到组织工程支架的标准，同时不能影响其生物相容性。因此，在利用丝素蛋白进行静电纺丝过程中，往往从装置、工艺和原料上做一些改变和处理，达到提高材料机械性能及提高其生物相容性的目的。笔者从材料的机械性能和生物性能两方面入手，就近年来对丝素蛋白在静电纺丝过程中的改性方法从物理、化学和装置等角度进行了归纳和阐述，从而展示了最新的研究成果。

1 静电纺SF物理改性

1.1 混入碳纳米管等无机物进行改性

Milind Gandhi等[4]用超声法将质量分数为1 %的碳纳米管(CNT)加入到SF中，成功制备了SF/CNT混纺纳米纤维毡。由于CNT具有高强高模的性质，且CNT的加入可能诱导SF发生结晶，利用FT-IR得到加入CNT的SF二级结构中β-折叠结构质量分数为64 %，提高了2 %，模量从纯纺SF的(140.67±2.21)MPa提高到(633.84±12.94)MPa，而强度也从(6.18±0.3)MPa提高到(13.89±0.9)MPa。将SF/CNT混纺纳米纤维经甲醇处理及牵伸之后，模量和强度都相应提高，加入CNT后，纤维的电导性提高对细胞的生长较有利。

Minsung Kang等[5]将质量分数为0.02 %的多壁碳纳米管(MWCNT)加入到SF中，通过静电纺丝法成功制备MWCNT/SF纳米纤维膜。经SEM观察，MWCNT的加入促使纳米纤维表面有微小的突起，而TEM结果显示MWCNT随丝素蛋白纳米纤维轴向分布，且分布均匀。通过拉曼光谱测试，MWCNT的加入不会影响丝素蛋白分子的结构和形态，而拉伸测试结果表明，MWCNT/SF纳米纤维膜的杨氏模量和断裂强度分别提高了48.2 %和49.3 %，但断裂伸长率有所下降。

1.2 混入P(LLA-CL)等合成高聚物进行改性

Kuihua Zhang等[6]将SF和P(LLA-CL)共混制备纳米纤维支架，探讨了SF和P(LLA-CL)的不同质量比对于纳米支架的机械性能的影响，当SF的质量分数增大时，材料脆性也增大，但由于P(LLA-CL)呈韧性，因此加入P(LLA-CL)可改善材料的脆性，其断裂应力和断裂伸长率相应提高。P(LLA-CL)具有疏水性基团，随着P(LLA-CL)质量分数的增加，SF的亲水性下降，但对于蛋白质的吸附能力增强，因此通过调整P(LLACL)/SF共混比来平衡材料的疏水性和亲水性。研究表明，当SF和P(LLA-CL)的质量比为25∶75时，支架对于细胞的培养是最为有利的；当SF和P(LLA-CL)的质量比为50∶50时，支架的空隙率最大，对细胞生长比较有利。因此，混入P(LLA-CL)对于SF的机械性能和生物性能都有所改善。

1.3 混入胶原蛋白、明胶、壳聚糖、异源丝素蛋白及丝胶等天然高聚物

Juan Zhou等[7]利用水作为溶剂，成功制备了胶原蛋白(GOL)/SF混纺纳米纤维毡，随着纺丝液浓度的增加，纤维变粗，形貌发生变化。胶原蛋白的加入量不同可影响纳米纤维的结晶度和直径，过多的胶原蛋白使纤维形貌呈带状，且结晶度略微下降，但含水率和应力变化不大。当GOL和SF的质量比为10∶100时，SF的结晶度最高，二级结构中β-折叠结构的含量最大。

Manunya Okhawilai[8]等利用SF和白明胶(gelatin)共混制备纳米纤维毡，通过改变电压和SF/gelatin的质量共混比来调节纤维的形貌、直径大小及分布。值得关注的是，通过EDC/NHS混合试剂对SF/gelatin混纺纳米纤维进行交联处理，使SF的二级结构从无规线团型和α-螺旋型向β-折叠型结构转变，从而使其降解速度减慢，力学性能增强。

Won Ho Park等[9]将壳聚糖(CS)混入SF中配成纺丝液进行静电纺丝，当SF和CS的质量比为70∶30时，可以得到连续的纤维，随着CS含量的增加，纤维直径从450 nm降到130 nm。将甲醇处理的纯纺SF和同样用甲醇处理的CS/SF混纺纳米纤维毡作对比，发现CS/SF混纺纳米纤维毡中SF从无规型转变到β-折叠型结构的速度更快一些，因为CS的刚性键可以通过分子间作用力加快SF的二级结构转变。

Feng Zhang等[10]在桑蚕丝SF中混入柞蚕丝丝素蛋白(TSF)，将质量百分比不同的SF/TSF纺丝液进行静电纺丝制备纳米纤维。经FT-IR和DTG测试表明，SF与TSF是不共混的，即不能形成共晶结构，它们有各自的晶区。由于TSF有较高的电导性，当TSF含量增加时，纤维变细。XRD显示，当SF质量分数达到60 %以上时，SF可改变TSF的结晶性，即当TSF的质量分数低于40 %时，TSF的二级结构由无规结构向β-折叠型结构的转变将被阻止。DTG测试显示，虽然SF的结晶性低于TSF，但当SF与TSF混纺时，SF/TSF纳米纤维有着更高的分解温度，即结晶区域面积增大。用MSCs、VECs和神经细胞在SF/TSF纳米纤维支架上的生长情况证明了SF/TSF纳米纤维支架有利于细胞的生长和繁殖。

Chang Seok Ki等[11]将丝胶(SS)混入SF中配制成纺丝液，对纺丝液进行旋转剪切后进行静电纺丝。当在剪切力作用下，SS/SF共混纺丝液中SF的分子链规则排列，呈β-折叠型结构。这是因为SS与SF之间存在氢键作用，使得SS与SF之间作用力增强，而在剪切力作用下，SS将缠绕的SF分子链拉直。因此，当SF水溶液中混有SS时，在剪切外力作用下，SF的分子链更容易取向。通过FTIR、CD和13C NMR分析得出，SS/SF纺丝液受到剪切作用后，经静电纺制备得到的SS/SF混纺纳米纤维的二级结构已从无规状向β-折叠型结构转变。

Michiko Sato等[12]将制备好的静电纺纳米纤维支架管外再包裹一层海绵状丝素蛋白，这种新的复合管结构可以运用于血管组织工程领域，复合之后的支架材料的拉伸强度和弹性模量明显提高，液体渗透率下降，但仍符合血管液体渗透率的标准。

1.4 与多种无机物和有机物复合

Chunmei Li等[13]将骨形态发生蛋白2型(BMP-2)、PEO、nHAP混入SF中，通过静电纺制备纳米纤维毡。通过比较SF/PEO、Silk/PEO-PEO(除去PEO)，SF/PEO/BMP-2、SF/PEO/nHAP、SF/PEO/nHAP/BMP-2这5组混纺纳米纤维支架上的钙沉积量的多少，得到加入BMP-2的纳米支架对于钙的沉积效果是最好的，且通过hMSCs在这5组支架上的培养情况看，nHAP的加入有利于骨的形成。

1.5 通过交联剂进行改性

Simone S Silva等[14]将天然的、无毒性的交联剂京尼平[15](GE)添加到SF中，进行混纺制备纳米纤维毡。随着GE含量的增加，纺丝液的导电性增加，可纺性增强，纤维也相应变细，同时混纺纤维毡在水中的稳定性也增强。从FTIR谱图得到，随着GE含量的增多，β-折叠型结构含量也相应增多。

1.6 制备核壳结构进行改性

Mao Wang等[16]利用双流静电纺丝法制备SF/PEO核壳结构的纳米纤维毡，然后将其静置在湿度为90 %、室温下72 h，WAXD及FT-IR显示SF的二级结构已经从无规状结构向β-折叠结构转变了，然后用水除去PEO，得到直径更细(约为170 nm)且粗细均匀的SF全晶型实心纳米纤维。该法的优势是不使用甲醇等化学物质就能使SF的二级结构发生转变，而制得的纤维更细，比表面积更大。

Shudong Wang等[17]将聚乳酸(PLA)作为壳，SF与白明胶(gelatin)共混物作为核，成功制备了新型纳米纤维管——PLA/SF-gelatin纳米纤维管，这是一根内径为4.5 mm，厚度为0.5 mm，长度为40 mm的管子，主要运用于血管组织工程支架领域。该材料的断裂强度为(1.28±0.21)MPa，由于PLA有较好的韧性，所以断裂伸长率达到(41.11±2.17)%，而破裂强度达到(111.4±2.6)kPa，高于自然血管的标准。用HUVECs细胞在支架上生长实验证明，该支架有利于细胞生长，且由于孔隙率为(82±2 %)，对细胞的生长和繁殖将更为有利。

Guibo Yin等[18]用PLA作为壳，用SF与白明胶(gelatin)共混作为核静电纺制备核壳结构的纳米纤维支架，其中SF和gelatin的质量比为70∶30和50∶50，从扫描电镜观察到PLA/SF-gelatin(50∶50)的纤维较PLA/SF-gelatin(70∶30)更细，为(134±14)nm，且孔隙率也从87 %增加到89 %，证明白明胶可增加其电纺性，使纳米纤维毡具有更大的比表面积，有利于细胞的黏附和生长。

2 静电纺SF化学改性

2.1 利用水蒸气对纳米纤维进行处理

Yutaka Kawahara等[19]利用水蒸气对静电纺SF纳米纤维进行表面处理，使其二级结构从无规到有序结构转变，以此达到提高丝素蛋白纳米纤维的力学性能。

Byungmoo Min等[20]利用水蒸气处理静电纺SF纳米纤维毡，用IR和13C-NMR测得SF二级结构已从无规型或α-螺旋型向β-折叠型转变，且β-折叠型的区域面积占总结构的47 %，低于用甲醇处理SF的74 %，因此材料的力学性能不像用甲醇处理后那么脆，韧性相对较好。而NHEF细胞在对用水蒸气或甲醇处理后的SF纳米纤维毡的生长情况作对比发现，用水蒸气处理的SF纳米纤维毡更有利于NHEF细胞的生长。

2.2 利用醇类对纳米纤维进行处理

Kuihua Zhang等[21]分别制备了质量分数分别为20 %、25 %、30 %和35 %的静电纺SF纳米纤维毡，通过扫描电镜观察到随着质量分数的提高，纤维直径增大。且经过甲醇处理后，经WAXD及AFM分析得到，SF的二级结构已从无规状向有序状转变，细胞培养实验也证实SF纳米纤维毡对于细胞的生长和繁殖是有利的。

Benedetto Marelli等[22]制备了SF纳米纤维管，主要运用于血管组织工程领域中的小口径血管组织修复。分别用甲醇处理5、10、15 min，随着处理时间的延长，从DSC的熔融和分解温度升高及焓变增加可看出，SF中无规结构向β-折叠型转变的程度加深。从材料的机械性能来看，SF纤维管抗内压值高于Dacron管和牛异体移植管抗内压值，但低于人体隐静脉和脐静脉抗内压值。

Juan Zhou等[23]成功制备了纯纺丝素蛋白纳米纤维血管组织工程支架，通过对纺丝电压、纺丝距离、纺丝液浓度及纺丝流率等工艺参数的探讨，得出最佳工艺参数为18 kV电压、18 cm的纺丝距离、37 %的质量分数及0.15 mL/min的流率。得到的纳米支架经过甲醇处理后，其断裂强度增加到3.57 MPa，通过FT-IR和XRD可知SF二级结构已从无规状向β-折叠型转变，孔隙率为80.85 %，符合血管组织工程支架的要求，适合细胞生长。

用甲醇等醇类对丝素蛋白改性[24]，增强其力学性能，是目前为止运用最为普遍的方法，该方法操作简单，二级结构从无规向β-折叠型转变效率较高，效果较好。但由于β-折叠型含量过高而使得材料较脆，而甲醇作为一种化学物质残留在SF中对SF的生物活性也有一定影响，因此此法并不是最理想的。

2.3 用降低pH值的方法进行改性

Jingxin Zhu等[25]用缓冲溶液调节SF纺丝液的pH值，配成5组纺丝液，pH值分别为6.9、6.0、5.6、5.2和4.8。随着pH值的下降，疏水基团被引入，致使SF黏度上升，因此在配制纺丝液时纺丝液质量分数随着pH值的下降而适当降低。实验证明当pH值为6.9时，质量分数大于33 %的纺丝液由于黏度过低而无法纺丝。当pH值为4.8时，质量分数大于25 %的纺丝液不能进行静电纺丝。广角XRD和拉曼光谱分析表明，随着pH值的下降，SF的二级结构从无规向β-折叠型转变，但转变量不大。随着pH值从6.9降到4.8，纳米纤维直径也从893 nm降到265 nm，纤维形貌从带状逐步转变成圆柱状。

2.4 利用等离子体进行表面处理

Lim Jeong等[26]分别利用氧气(O2)和甲烷(CH4)等离子体处理静电纺SF纳米纤维毡，将处理后的纳米纤维毡作为ECM用人体表皮角化细胞(NHEK)和成纤细胞(NHEF)进行细胞培养，对比发现用O2等离子体处理的纳米纤维毡比用CH4处理或未处理的纳米纤维毡更有利于细胞的生长和繁殖，因为用O2等离子体处理SF，可使SF纳米纤维表面的亲水性增强。

3 改变收集装置

Yutaka Kawahara等[19]将收集装置进行改装，制作出利用两条平行金属板，两板留有5 mm的缝隙进行收集，得到并排平行取向的纳米纤维，且二级结构也向β-折叠型结构转变。

M J McClure等[27]通过改变收集装置圆杆的转速来提高材料的力学性能。将聚己内酯(PCL)和聚二恶烷酮(PDO)分别与SF混纺，混纺质量比都为50∶50，收集杆的转速设定为8.33 r/s和133.33 r/s，得到混纺纳米纤维圆管，用于血管组织工程支架领域。从力学测试得到，PCL、PCL/SF、PDO/SF的模量分别从4.2、3.5和1.9 MPa提高到5.0、5.7和2.3 MPa，而最大强度也从2.6、1.1和0.9 MPa提高到5.2、2.6和1.7 MPa。同时也证明PCL/SF的力学性能优于PDO/SF。

4 结 语

近年来，静电纺再生丝素蛋白纳米纤维支架作为一种新型的组织工程支架，已越来越普遍受到人们的关注，静电纺丝法作为制备纳米材料的技术手段也得到了空前的发展，材料在力学方面的种种缺陷也通过科研人员的努力得到了很大的改善。但无论是通过何种方法对其进行改性，都不能影响其作为生物材料的基本性能，如生物相容性等。通过化学的方法虽然可以使其力学性能有一定的提高，但由于改变了材料原来的结构而使得其生物性能有所改变，因此对于静电纺丝素蛋白的改性今后仍应侧重运用物理方法，主要是共混其他力学性能优良的聚合物及制备形状特殊的纳米纤维支架，如核壳结构等。相信随着研究的不断深入，静电纺再生丝素蛋白纳米纤维支架在多个领域的应用将越来越广泛，优势也将越来越明显。

[1] CHIKAKO Tanaka, TESTUO Asakura. Synthesis and characterization of cell-adhesive silk-like proteins constructed from the sequences of anaphe silk fi broin and fi bronectin[J].Biomacromolecules, 2009, 10(4):923-928.

[2] ALESSANDRINO A, MARELLI B, AROSIO C, et al.Electrospun silk fibroin mats for tissue engineering[J].Engineering In Life Sciences, 2008, 8(3):219-225.

[3] YANG Yu Hong, SHAO Zheng Zhong, CHEN Xin, et al.Optical spectroscopy to investigate the structure of regenerated bombyx mori silk fi broin in solution[J]. Biomacromolecules,2004, 5(3): 773-779.

[4] GANDHI Milind, YANG Heejae, SHOR Lauren, et al.Post-spinning modification of electrospun nanofiber nanocomposite from Bombyx mori silk and carbon nanotubes[J]. Polymer, 2009, 50 (8) :1918-1924.

[5] KANG Min Sung, CHEN Peng, JIN Hyoung Joon, et al.Preparation of multiwalled carbon nanotubes incorporated silk fibroin nanofibers by electrospinning[J]. Current Applied Physics, 2010, 9(1): 95-97.

[6] ZHANG Kui Hua, WANG Hong Sheng, HUANG Chen,Fabrication of silk fi broin blended P(LLA-CL) nano fi brous scaffolds for tissue engineering[J]. Biomed Mater Res A,2010, 93(3):984-993.

[7] ZHOU Juan, CAO Chuan Bao, MA Xi Lan, et al. Electrospinning of silk fi broin and collagen for vascular tissue engineering[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2010, 47(4):514-519.

[8] OKHAWILAI Manunya, RANGKUPAN Ratthapol,KANOKPANONT Sorada, et al. Preparation of thai silk fibroin/gelatin electrospun fiber mats for controlled release applications[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2010, 46(5):544-550.

[9] PARK Won Ho, JEONG Lim, YOO Dong Il, et al. Effect of chitosan on morphology and conformation of electrospun silk fi broin nano fi bers[J]. Polymer, 2004, 45(21):7151-7157.

[10] ZHANG Feng, ZUO Bao Q, ZHANG Huan X, et al. Studies of electrospun regenerated SF/TSF nano fi bers[J]. Polymer,2009, 50 (1): 279-285.

[11] KI Chang Seok, UM In Chul, PARK Young Hwan.Acceleration effect of sericin on shear-induced β-transition of silk fi broin[J]. Polymer, 2009, 50 (19): 4618-4625.

[12] SATO Michiko, NAKAZAWA Yasumoto, TAKAHASHI Rui. Small-diameter vascular grafts of bombyx mori silk fi broin prepared by a combination of electrospinning and sponge coating[J]. Materials Letters, 2010, 64(16): 1786-1788.

[13] LI Chun Mei, VEPARI Charu, JIN Hyoung Joon, et al.Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering[J]. Biomaterials,2006, 27 (16): 3115-3124.

[14] SILVA Simone S, MANIGLIO Devid, MOTTA Antonella,et al. Genipin-modi fi ed silk-fibroin nanometric nets[J].Macromol Biosci. 2008, 8:766-774.

[15] TREVOR Susannah L, BUTLER Micheal F, ADAMS Sarah, et al. Structure and phase transitions of genipin, an herbal medicine and naturally occurring cross-linker[J].Crystal Growth & Design, 2008, 8(5): 1748-1753.

[16] WANG Mao,YU Jian H, KAPLAN David L, et al.Production of submicron diameter silk fibers under benign processing conditions by two-fluid electrospinning[J]. Macromolecules, 2006, 39: 1102-1107.

[17] WANG Shu Dong, ZHANG You Zhu, YIN Gui Bo, et al.Electrospun polylactide/silk fibroin–gelatin composite tubular scaffolds for small-diameter tissue engineering blood vessels[J]. Journal of Applied Polymer Science,2009, 113(4):2675-2682.

[18] YIN Gui Bo, ZHANG You Zhu, WANG Shu Dong, et al.Study of the electrospun PLA/silk fi broin-gelatin composite nanofibrous scaffold for tissue engineering[J]. J Biomed Mater Res A, 2010, 93(1):158-163.

[19] KAWAHARA Yutaka, ATSUSHI Nakayama, NORIAKI Matsumura, et al. Structure for electrospun silk fibroin nano fi bers[J]. Journal of Applied Polymer Science, 2008,107(6):3681-3684.

[20] MIN Byung Moo, JEONG Lim, LEE Kuen Yong, et al. Regenerated silk fi broin nano fi bers: water vapor-induced structural changes and their effects on the behavior of normal human cells[J]. Macromolecular Bioscience,2006, 6(4):285-292.

[21] ZHANG Kui Hua, MO Xiu Mei, HUANG Chen. Electrospun scaffolds from silk fibroin and their cellular compatibility[J]. Biomed Mater Res A, 2010,93(3):976-983.

[22] MARELLI Benedetto, ALESSANDRINO Antonio,FARE Silvia, et al. Compliant electrospun silk fibroin tubes for small vessel bypass grafting[J]. Acta Biomaterialia,2010, 6(10):4019-4026.

[23] ZHOU Juan, CAO Chuan Bao,MA Xi Lan, et al. A novel three-dimensional tubular scaffold prepared from silk fibroin by electrospinning[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2009, 45 (5):504-510.

[24] MIN Byung Moo, LEESO Gene, KIM Hyun, et al. Electrospinning of silk fi broin nano fi bers and its effect on the adhesion and spreading of normal human keratinocytes and fi broblasts in vitro[J]. Biomaterials, 2004, 25 (7/8):1289-1297.

[25] ZHU Jing Xin, ZHANG Yao Peng, SHAO Hui Li, et al.Electrospinning and rheology of regenerated Bombyx mori silk fibroin aqueous solutions: the effects of pH and concentration[J]. Polymer, 2008, 49(2):2880-2885.

[26] JEONG Lim, YEO In Sung, KIM Ha Na, et al. Plasmatreated silk fibroin nanofibers for skin regeneration[J].International Journal of Biological Macromolecules,2009, 44 (3):222-228.

[27] MCCLURE M J, SELL S A, AYRES C E, et al. Electros pinning-aligned and random polydioxanone polycaprolactone silk fibroin-blended scaffolds: geometry for a vascular matrix[J]. Biomed Mater, 2009, 4 (5): 1-13.

Progress in the modification of electrospun regenerated silk fibroin

BIAN Rui-qi, XIONG Jie
(Key Laboratory of Advanced Textile Materials and Manufacturing Technology Ministry of Education, Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou 310018, China)

As we know, silk fibroin plays a good biological compatibility. However, the poor mechanica l property has become a great issue to expand its applications. Great attention has been paid by researchers at home and abroad. On the basis of their efforts, it can be concluded that the properties of silk fibroin can be well strengthened using physical or chemical methods, or changing the device during the electrospinning. The viewpoint that physical modify processes including co-blending with other polymers and fabricating fiber with special structures are effective for modification, has been proposed in this paper.

Electrospinning; Silk fibroin; Tissue engineering scaffolds; Modification

TS102.3

A

1001-7003(2011)05-0023-05

2010-11-27；

2011-03-07

973计划前期研究课题(62008CB61750)；浙江省自然科学基金重点项目(Z4100798)

边瑞琦(1984－ )，男，硕士研究生，研究方向为静电纺纳米纤维及其生物医学性能。通迅作者：熊杰，教授，博导，jxiong@zstu.edu.cn。