Caspase信号转导通路在高糖引发牙周膜细胞凋亡中的作用*

刘加强 刘洪臣 冯 元 高 辉

Caspase家族是近几年研究的热点之一，属于ICE/CED3蛋白酶家族成员，现已发现至少有14种。该家族与细胞凋亡密切相关，它是通过级联放大反应，最终激活核酸内切酶来实现介导细胞凋亡的[1]。在众多的Caspase家族成员中，Caspase-3处于凋亡环节的核心部位，对整个细胞凋亡过程起着决定性作用[2]，因此，本实验目的在于探讨Caspase-3在高糖环境下引起的体外人牙周膜细胞凋亡过程中的作用。本实验分别采用葡萄糖浓度为5.5mmol/L，15mmol/L，25mmol/L，35mmol/L的DMEM培养基培养人牙周膜细胞，时间为24小时，并采用Caspase-3特异性抑制剂z-DEVD-fmk为对照，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，Western-blot法检测Caspase-3蛋白酶原(procaspase-3)和裂解后有活性的蛋白酶(cleaved Caspase-3)变化情况，明确Caspase细胞凋亡通路在此过程中的作用。

1.材料与方法

1.1 材料

z-DEVD-fmk(Santa cruz)，β-actin 兔多克隆抗体(Santa cruz)，蛋白质分子量Marker(天根生化科技有限公司，北京)，显影液定影液(尚柏生物PCP010，北京)，DYCP-31D型水平式电泳槽(宾达英创科技有限公司，北京)，DYY-7C型电泳仪(六一仪器厂，北京)，温控超速离心机(Eppendorf，Germany)，转膜仪(J-MAX)。

1.2 方法

本实验采用组织块法、酶消化法和盖玻片固定相结合进行人牙周膜细胞的原代培养。取因正畸治疗拔除的的健康前磨牙4颗，用含有1000单位/升青霉素和链霉素的0.01mol/L PBS反复冲洗后，无菌条件下，用锐利的刀片刮取根中1/3区域的牙周膜组织，0.3%Ⅰ型胶原酶5毫升消化30min，1500转/分离心5min，弃上清液，沉淀物用2毫升含20%胎牛血清的DMEM培养基重悬洗涤，1200转/分离心5 min，弃上清液，沉淀物平铺于6孔培养板中，用洗净并消毒的盖玻片压紧，防止加入培养液时组织块浮起，加入1.5毫升含20%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下于恒温孵箱中静置培养。

1.2.1 实验分组

本实验共分五组，每组3个样本：

第一组：葡萄糖浓度为5.5mmol/L

第二组：葡萄糖浓度为15mmol/L

第三组：葡萄糖浓度为25mmol/L

第四组：葡萄糖浓度为35mmol/L

第五组：葡萄糖浓度为35mmol/L，该组中加入Caspase-3特异性抑制剂z-DEVD-fmk，浓度为2μmol/L。采用流式细胞仪定量检测每组细胞凋亡情况，Western-blot法检测Caspase-3蛋白酶原(procaspase-3)和裂解后有活性的蛋白酶(cleaved Caspase-3)变化情况。

1.2.2 实验数据统计学处理

运用SPSS13.0软件包，对所得结果进行单因素方差分析，P＜0.05为具有显著性差异。

2.结果

细胞培养的最初3d，倒置显微镜下未见有成纤维样细胞爬出，随着培养时间延长，在接种后7－10d左右可见组织块周围有少量细胞长出，贴壁生长，以组织块为中心，呈放射状排列。15d左右细胞彼此接触融合成片，大约达到24孔板底面的80%，个别部位有细胞重叠现象，此时应进行传代。5～8代的细胞形态一致，性质稳定，立体感强，生长状况良好，适合进行有关的研究实验。

2.1 流式细胞仪结果

流式细胞仪定量分析各组凋亡细胞百分比，每组三个样本：

第一组：葡萄糖浓度为5.5mmol/L，24小时2.6%，3.4%，3.1%

第二组：葡萄糖浓度为15mmol/L，24小时3.7%，4.1%，2.6%

第三组：葡萄糖浓度为25mmol/L，24小时4.4%，5.2%，5.6%

第四组：葡萄糖浓度为35mmol/L，24小时6.3%，7.5%，7.6%

第五组：糖35mmol/L+z-DEVD-fmk，24小时 4.1%，5.7%，5.3%

每组均值及方差及凋亡情况对比情况见图1，2。

图1 各组细胞凋亡百分比与5.5mmol/L比较：**P＜0.01

从表中可以看出，总体趋势是随着葡萄糖浓度的增高，牙周膜细胞凋亡比例升高，但总的细胞凋亡比例均小于10%，说明各组凋亡的细胞只占到很小一部分，大部分细胞没有发生凋亡。

图2 各组细胞凋亡百分比与5.5mmol/L比较：**P＜0.01；与35mmol/L+DEVD组比较：##P＜0.01

从表中可以看出，Caspase-3特异性抑制剂z-DEVD-fmk可以显著抑制高糖引发的牙周膜细胞凋亡，说明Caspase-3细胞凋亡途径参与了这一过程。但z-DEVD-fmk不能够完全抑制高糖引发的牙周膜细胞凋亡，说明除了Caspase-3细胞凋亡途径外，还有其他途径参与了这一过程。

2.2 Caspase-3蛋白表达结果

Western-blot法测定每组 Caspase-3酶原(pro-caspase-3)和 活 性 Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白含量，电泳后采用软件分析各组染色条带灰度值，实验重复三次后用SPSS13.0软件进行统计学分析，结果见图3。

图3 pro-caspase-3以及cleaved Caspase-3蛋白含量变化情况与5.5mmol/L比较：*P＜0.05，**P＜0.01

从表中可以看出，随着糖浓度的增加，cleaved Caspase-3含量逐渐增加，说明细胞凋亡活动逐渐增强，但pro-caspase-3浓度没有变化，说明发生凋亡的细胞只占了很小一部分比例，大部分细胞没有发生凋亡，这点与流式细胞仪结果相一致。大量正常活细胞内的pro-caspase-3含量掩盖了小部分凋亡细胞内因活化而减少的pro-caspase-3，因此检测不出变化。而cleaved Caspase-3在正常细胞内没有或是含量甚微，因此少量的变化即可被检测出来。加入Caspase-3特异性抑制剂z-DEVD-fmk后cleaved Caspase-3的含量与35mM组比较没有变化，说明z-DEVD-fmk并不能抑制procaspase-3被活化成cleaved Caspase-3，只能抑制cleaved Caspase-3的活性。

3.讨论

Caspase即半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶，是一组具有相似的氨基酸序列和二级结构的半胱氨酸蛋白酶，不但与真核细胞凋亡密切相关，还参与多种细胞因子的成熟、细胞生长以及分化[3-6]。Caspase的底物种类较多，但主要对象是DNA修复调节因子、细胞骨架、RNA剪接以及细胞周期中的某些成员，而不是广泛地降解多种蛋白质。Caspase抑制剂可分为人工合成的酶抑制剂、天然的酶抑制剂与拮抗Caspase酶作用的三类。人工合成的抑制剂主要作用部位是Caspase活性中心，分为肽类和非肽类抑制剂，其中肽类抑制剂因为特异性高，易于合成，成本较低，因而被广泛应用，如z-DEVD-fmk，Ac-DEVD-CHO等。

根据预实验及参考文献[7,8]，我们选择葡萄糖浓度为5.5mmol/L，15mmol/L，25mmol/L，35mmol/L的DMEM培养基培养人牙周膜细胞，高糖作用时间为24小时，因人体内正常血糖浓度大约为5.5mmol/L，因此本实验中葡萄糖浓度为5.5mmol/L的实验组可看作是生理对照组。z-DEVD-fmk作为实验室常用的Caspase-3特异性抑制剂已被广泛应用，因此本实验选择z-DEVD-fmk作为抑制剂对照，终浓度为2μmol/L，在加入葡萄糖前2小时加入[9]，以明确Caspase通路在此过程中的作用。

从本实验流式细胞仪结果中可以看出，随着糖浓度的增高，牙周膜细胞凋亡比例也随之增加，说明高糖可以引发人牙周膜细胞的凋亡，与以往文献报道相一致[10,11]，但凋亡比例都不高，都在10%以下，与体内实际情况相一致，加入Caspase-3抑制剂z-DEVD-fmk后，细胞凋亡比例明显低于未加入组，说明z-DEVD-fmk可以抑制高糖引起的牙周膜细胞凋亡，这进一步证实了高糖引起的牙周膜细胞凋亡是由Caspase-3介导的。此外，z-DEVD-fmk组细胞凋亡比例明显高于生理糖浓度组，这说明z-DEVD-fmk不能完全阻断高糖引起的牙周膜细胞凋亡，这种情况有两种可能，第一，z-DEVD-fmk并不能完全抑制Caspase-3功能，只降低其活性，Caspase-3仍然可以发挥部分介导细胞凋亡的作用。因此就会出现加入z-DEVD-fmk后的高糖组细胞凋亡百分比低于不加入z-DEVD-fmk的高糖组，但却高于生理糖浓度组。第二，z-DEVD-fmk可以完全抑制Caspase-3功能，但这一凋亡过程并不是完全是由Caspase-3介导的，还存在其他调控途径，因此加入z-DEVD-fmk后只能抑制Caspase-3介导的这部分细胞凋亡，却并不能抑制其他途径介导的细胞凋亡，因此也会出现上述的结果。但具体是哪种机制还需证实。对Caspase-3的检测结果可以看出，随着糖浓度的增加，虽然未裂解的无活性的酶原pro-caspase-3浓度没有变化，但有裂解后有活性的cleaved Caspase-3含量逐渐增加，说明细胞凋亡活动逐渐增强，但发生凋亡的细胞只占了总量的很小一部分比例，大部分细胞没有发生凋亡现象，这点与体内实际情况和流式细胞仪结果相一致。大量正常活细胞内的pro-caspase-3含量掩盖了小部分凋亡细胞内因活化而减少的pro-caspase-3，而且即使在少部分发生凋亡的细胞内，也不是所有的pro-caspase-3酶原均发生了裂解活化，因此检测不出变化。而cleaved Caspase-3在正常活细胞内没有或是含量甚微，因此少量的变化即可被检测出来。加入Caspase-3特异性抑制剂z-DEVD-fmk后cleaved Caspase-3的含量与35mM组比较没有变化，说明z-DEVD-fmk并不能抑制pro-caspase-3被活化成cleaved Caspase-3，只能抑制cleaved Caspase-3的活性。

[1]Dotto GP,silke J.More than cell death：caspases and caspase inhibitors on the move[J].Dev Cell.2004 Jul，7(1)：2-3

[2]刘加强,刘洪臣.细胞凋亡及其在牙周领域中的研究进展[J].中华老年口腔医学杂志，2010，8(2)：110-113

[3]Paul Tawa,Andre Giroux,Erich Grimm,et al.Correlating the fractional inhibition of caspase-3 in NT2 cells with apoptotic markers using an active-caspase-3 enzyme-linked immunosorbent assay[J].Analytical Biochemistry， 2006，350(1)：32-40

[4]Mami Yamamoto,Yayoi Kamata,Toshii Iida,etal.Quantification of activated and total caspase-14 with newly developed ELISA systems in normal and atopic skin[J].Journal of Dermatological Science，2011，61(2)：110-117

[5]Noriyuki Miyoshi，Kisa Naniwa,Takeshi Kumagai,et al.α-Tocopherol-mediated caspase-3 up-regulation enhances susceptibility to apoptotic stimuli[J].Biochemical and Biophysical Research Communications， 2005， 334(2)：466-473

[6]Maryla Krajewska,Robert E.Rosenthal,Jowita Mikolajczyk,et al.Early processing of Bid and caspase-6,-8,-10,-14 in the canine brain during cardiac arrest and resuscitation[J].Experimental Neurology， 2004， 189(2)：261-279

[7]Kumiko Kaifu1,Hideyasu Kiyomoto1,Hirofumi Hitomi1,et al.Insulin attenuates apoptosis induced by high glucose via the PI3-kinase/Akt pathway in rat peritoneal mesothelial cells[J].Nephrol Dial Transplant， 2009， 24：809-815

[8]Takata H,Ikeda Y,Suehiro T,et al.High glucose induces transactivation of the alpha2-HS glycoprotein gene through the ERK1/2 signaling pathway[J].J Atheroscler Thromb，2009，16(4)： 448-456

[9]S，eref Barut,Yusuf Atilla U¨nlü,Alper Karaogˇlan,et al.The neuroprotective effects of z-DEVD.fmk,a caspase-3 inhibitor,on traumatic spinal cord injury in rats[J].Surgical Neurology，2005，64(3)： 213-220

[10]Ali.M.Sharifi,Habib Eslami,Bagher Larijani,et al.Involvement of caspase-8, -9, and -3 in high glucose-induced apoptosis in PC12 cells[J].Neuroscience Letters，2009，459(2,7)：47-51

[11]David A.Allen,Muhammad M.Yaqoob,Steven M.Harwood.Mechanisms of high glucose-induced apoptosis and its relationship to diabetic complications[J].The Journal of Nutritional Biochemistry，2005，16(12)：705-713