HLA-DRB1等位基因多态性与慢性乙型肝炎、肝硬化关联性的临床研究

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 CHB组32例，其中男22例，女10例，年龄15～50〔平均(38.5±15)〕岁，临床诊断符合CHB防治指南的诊断标准〔1〕，并且排除有其他肝炎病毒感染者;乙型肝炎肝硬化组36例，男19例，女17例，年龄20～70〔平均(40±12)〕岁。均有乙肝病史，均经肝穿活检确诊;ASC组34例，其中男18例，女16例，年龄20～60〔平均(38±12)〕岁;健康对照组39例，其中男20名，女19名，年龄20～45〔平均(30.5±10)〕岁。CHB组、肝硬化组、ASC组、健康对照组在性别与年龄方面无显著差异，具有可比性。同时根据HBV-DNA定量检测结果，将其中的102例HBV感染者分为HBV-DNA阳性组(≥1×103拷贝/ml)和HBV-DNA阴性组(＜1×103拷贝/ml)，比较两组间HLA-DRB1各等位基因的频率差异。

1.1.2 主要仪器与试剂 HERMILE E383K型高速台式低温离心机(德国)、HYBAID PCR仪(英国)、BDME20微型电泳仪(中国);DNA提取试剂由AXYGEN BIOSCIENCE(原杭州维特浩生化技术服务有限公司)提供;Marker(DL2000)、dNTP、Taq酶均购自宝生物工程(大连)有限公司;引物由上海(生工)生物工程技术服务有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 样品采集及处理分别取患者和健康对照者外周肘静脉血5 ml，2 ml注入依地酸二钠(EDTA-Na2)抗凝管中，抗凝血颠倒混匀以备提取DNA;3 ml注入普通试管，自凝血立即以10 000 r/min离心5 min，离心后取血清测HBV-DNA载量。

1.2.2 HBV-DNA测定取患者血清样本以及试剂盒中的对照品100μl，分别加入0.5 ml离心管中;依次加入不同的DNA提取液提取DNA，具体操作步骤按说明书进行(试剂盒购自深圳匹基公司，引物由该公司设计并合成)，定量PCR分析仪(美国罗氏公司)扩增测定DNA含量。

1.2.3 外周血单个核细胞DNA提取采用全血DNA抽提纯化试剂盒(AXYGEN SCIENCE)。严格按照试剂说明书进行操作。基本过程:红细胞被裂解后，被保留的白细胞经过清洗剂及蛋白酶的处理，将DNA从核中释放出来。然后，用蛋白清除剂清除沉淀蛋白及RNA。最后，用乙醇沉淀DNA。DNA提取后用紫外分光光度计检测DNA含量，A260/A280为1.65～2.0。DNA置－20℃冰箱保存。

1.2.4 PCR扩增根据参考文献〔2〕设计出扩增DRB1片段的通用引物6对，选用人生长激素(hGH)基因片段作为内对照，引物序列及扩增长度见表1，所有引物均由上海生工生物工程技术公司合成。采用PCR-SSP方法进行DRB1等位基因的扩增，PCR反应条件:94℃预变性3 min;循环参数为94℃变性45 s，65℃退火45 s，72℃延伸 60 s，循环 30 次;最后 72℃再延伸5 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯下观察HLA-DRB1等位基因表达情况。

1.3 统计学分析用直接计数法计算等位基因频率。各组间等位基因的比较、两组间等位基因分布的差异采用χ2检验，应用SPSS17.0统计软件进行分析，计算χ2值及P值。

表1 PCR扩增引物序列及扩增长度

2 结果

2.1 HLA-DRB1基因PCR-SSP产物琼脂糖凝胶电泳分析见图1。

图1 HLA-DRB1基因PCR-SSP产物琼脂糖电泳结果

2.2 HLA-DRB1等位基因在各组间分布情况比较见表2，表3。CHB组HLA-DRB1*0701基因频率为10.94%，健康对照组频率为1.28%，差异具有统计学意义(P＜0.05)。HLADRB1*0701在肝硬化组基因频率为12.50%，明显高于健康对照组，差异具有统计学意义(χ2=5.88，P＜0.05)。健康对照组与ASC组基因频率较高的位点为HLA-DRB1*0301/04(15.38%)，但与CHB组、肝硬化组相比较差异无显著性。其他等位基因频率其他三组与对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。HLA-DRB1等位基因频率在HBV-DNA阳性组与阴性组无显著性差异。

表2 CHB组、ASC组、肝硬化组和健康对照组HLA-DRB1等位基因分布情况〔n(%)〕

表3 HBV-DNA阳性组与HBV-DNA阴性组HLA-DRB1等位基因分布比较〔n(%)〕

3 讨论

HLA-Ⅱ类分子主要表达在某些免疫细胞表面，作为辅助性T细胞CD4+的识别标志之一，参与外源性抗原的递呈。HLA的晶体结构研究表明:Ⅱ类α链和β链的远膜区有一个抗原结合槽，与疾病相关的关键性氨基酸分布其中，序列氨基酸的排列顺序是由每个等位基因编码的，由于HLA-Ⅱ类分子等位基因的多态性，导致了抗原结合槽的构象、结合及递呈抗原肽递呈T细胞的效率不同;HLA-Ⅱ类分子呈递外源性抗原肽给予CD4+T细胞，促使其活化，分化为效应细胞(Th细胞)，分泌不同的细胞因子，发挥不同的免疫效应，影响疾病的转归。有研究表明CHB患者存在一定的免疫功能紊乱现象，主要表现为T细胞数量失衡和活化异常〔3〕。

有关HLA-DRB1等位基因多态性与疾病关系报道很多〔4～6〕，本研究以吉林地区汉族人群为研究对象，探讨HLADRB1等位基因多态性与CHB、肝硬化及HBV复制状态的相关性，结果表明，在吉林地区汉族人群中HLA-DRB1*0701等位基因型与CHB相关，可能是CHB易感基因或连锁基因，与钱毅等〔7，8〕的研究结果一致，但与韩瑜〔9〕等的结果不同，可能与样本量、地域等因素有关。HBV导致肝细胞损害具体机制尚不十分明确，本文研究未发现HLA-DRB1等位基因频率与HBV的复制状态存在关联。

1 中华医学会肝病学分会、感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南〔J〕.中华肝脏病杂志，2005;13(12):881-91.

2 Olerup O，Aldcner A，Fogdell A，et al.HLA-DQB1 and-DQA1 typing by PCR amplification with sequence-specific primers(PCR-SSP)in 2 hours〔J〕.Tissue Antigens，1993;41(3):119-34.

3 刘春华，崔速南，刘靓雯，等.慢性乙型肝炎肝硬化淋巴细胞亚群及HLA-DR抗原的表达〔J〕.中国现代医学杂志，2010;20(12):1825-8.

4 杨磊，王丽君，时广利，等.HLA-A、HLA-B、DRB1等位基因多态性与中国北方汉族肺癌患者遗传易感相关性的研究〔J〕.免疫学杂志，2010:26(7):612-9.

5 黄晓晖，陈思东.HLA-DRBI*0701基因与吸烟在乙肝疫苗免疫应答中的交互作用〔J〕.公共卫生与预防医学，2009;20(2):7-10.

6 潘焕峰，李东复，孙天虹，等.原发性肝细胞癌与HLA-DRB1基因多态性及DR抗原表达的关系〔J〕.中华肝胆外科杂志，2009;15(5):357-61.

7 钱毅，章廉，梁雪梅，等.广东汉族人群乙肝疫苗免疫应答水平与HLA-DRB1*02，07，09 的相关性〔J〕. 第一军医大学学报，2002;22(1):67-9.

8 袁俊华，孙成刚.山东地区慢乙肝的预后与HLA-DRB1等位基因相关性研究〔J〕.临床肝胆病杂志，2004;20(4):236-7.

9 韩瑜，马宁，焦立新.HLA-DRBI等位基因与吉林地区汉族人群慢性乙型病毒性肝炎的关联性分析〔J〕.吉林大学学报医学版，2010;36(4):741-4.