结肠癌转移淋巴结P-gp、Bcl-2、Bax表达与体外化疗敏感性的关系

石晓明 檀碧波 刘学军 韩 杰

(河北省人民医院胃肠外科，河北 石家庄 050051)

化疗是结肠癌综合治疗的重要措施，而肿瘤多药耐药(MDR)的存在常导致化疗失败，探讨MDR机制并寻找逆转靶点已成为肿瘤研究的热点。由于肿瘤进展过程中产生的亚克隆变化将使肿瘤在许多细胞学特性(包括MDR等方面)发生异质变化〔1，2〕，故进展期结肠癌切除术后化疗的目标应针对转移灶和/或残留病灶。P-糖蛋白(P-gp)的药泵作用和Bcl-2、Bax参与的凋亡调控途径在目前结肠癌MDR研究中受关注最多，但关于结肠癌转移灶P-gp、Bcl-2、Bax表达与化疗药敏性关系的报道尚罕见。本研究旨在探讨结肠癌原发灶和转移淋巴结P-gp、Bcl-2、Bax表达与肿瘤细胞体外化疗药物敏感性的关系。

1 材料与方法

1.1 对象 2006年10月至2009年2月在我院手术并经病理证实伴淋巴结转移的结肠癌48例，其中男26例，女22例，年龄36～80〔平均(64.5±14.54)〕岁。所有病例术前均未接受放化疗。每例肿瘤原发灶、相应淋巴结转移灶标本均经中性甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，苏木素-伊红(HE)染色病理诊断。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色法测定 P-gp、Bcl-2、Bax表达 鼠抗人P-gp、Bcl-2、Bax单克隆抗体及免疫组化试剂盒均购自北京中杉生物公司(美国，ZYMED公司产品)，采用SP法分别对肿瘤原发灶与阳性转移淋巴结进行上述指标免疫组化染色，染色步骤严格按试剂盒说明书进行操作。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。由两位病理医师分别双盲阅片进行结果判断。每张切片随机取5个高倍(400倍)视野，每个视野计数100个细胞，三种蛋白均以细胞膜及(或)细胞质着染呈黄色为阳性，按肿瘤细胞着色强度和阳性细胞率分别记分。着色强度记分:无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。肿瘤细胞阳性细胞率记分标准:阳性细胞≤5%为0分，6% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，≥76%为4分;两种记分标准所得分值的乘积为0或1为阴性(－)，2～3为弱阳性(+)，4～7阳性(⧺)，≥8强阳性(⧻)。

1.2.2 肿瘤细胞培养及化疗药敏性试验 术中标本离体后分别取新鲜肿瘤组织、转移淋巴结1～2枚各1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm置入双抗(青霉素G钠100 U/ml、链霉素200μg/ml)培养液，2 h内行原代细胞培养化疗药物敏感实验。转移淋巴结为术中清扫的可疑肿大淋巴结中切取少许组织，冰冻切片诊断并经术后病理证实。肿瘤原发灶、转移淋巴结组织经研磨分散，用细胞分离器调细胞浓度至5×105个/ml。培养前将肿瘤药敏检测板和DMEM培养基预温至37℃。10种受试药物为5-氟尿嘧啶(5-FU)、足叶乙甙(VP-16)、羟基喜树碱(HCPT)、紫杉醇(PTX)、奥沙利铂(L-OHP)、顺铂(CDDP)、表阿霉素(eADM)、吡喃阿霉素(THP)、丝裂霉素(MMC)、长春新碱(VCR)，药物终浓度为血浆峰值药物浓度〔2〕。每种药物设立3个复孔，同时设不加药物的细胞对照组。接种细胞悬液200μl/孔，微量振荡器振荡混匀，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养 48 h，加四甲基偶氮唑蓝(MTT)(5 mg/ml)20μl/孔，继续培养3～24 h，终止培养时间为显微镜下观察MTT还原形成蓝色针状结晶。将细胞培养板1 000 r/min离心10 min，弃上清，吸水纸吸去残留液体。加入DMSO 100μl/孔，轻轻振荡混匀，酶标仪570 nm测各孔A值。肿瘤细胞平均抑制率(IR)=(1－给药孔平均A值/对照孔平均A值)×100%。1.3 统计学处理 应用SAS8.0统计软件。计量资料采用配对t检验，等级资料使用Wilcoxon配对秩和检验、双变量相关分析并计算Spearman等级相关系数。

2 结果

2.1 结肠癌原发灶、淋巴结转移灶耐药相关因子表达强度比较 经Wilcoxon配对秩和检验，P-gp、Bax在转移灶中的表达程度明显高于原发灶(S=160.5，P＜0.001;S=111.0，P=0.021)，而Bcl-2在原发灶中表达强于转移灶(S=－176.5，P=0.003)。双变量相关分析显示，在原发灶与转移淋巴结间P-gp、Bax表达具有明显正相关性(r=0.660 6，P＜0.001;r=0.399 5，P=0.004 9);而Bcl-2表达在原发肿瘤与淋巴结转移灶间无明显相关性。见表1。

2.2 结肠癌原发灶、淋巴结转移灶化疗药敏试验结果 10种常用化疗药物对原发灶、淋巴结转移灶肿瘤细胞的平均抑制率不同。原发灶顺序依次为 PTX＞VCR＞L-OHP＞5-FU ＞HCPT＞CDDP＞eADM＞VP-16＞THP＞MMC;转移灶顺序依次为PTX＞5-FU＞eADM＞VP-16＞L-OHP ＞HCPT＞THP＞CDDP ＞VCR ＞MMC。其中5-FU、VP-16、THP、MMC 对转移淋巴结肿瘤细胞的抑制率高于原发灶;HCPT、L-OHP、CDDP、VCR对原发灶肿瘤细胞抑制率高于转移灶;PTX、eADM对两种组织肿瘤细胞的抑制率无明显差异。5-FU、HCPT、L-OHP、MMC、VCR对原发灶与淋巴结转移灶二者间肿瘤细胞抑制率具正相关性(r=0.293 1～0.384 1，均P＜0.05)，5种药物对原发灶与淋巴结转移灶肿瘤细胞抑制率均有显著性差异(均P＜0.05);而VP-16、PTX、CDDP、eADM、THP对原发灶与淋巴结转移灶肿瘤细胞抑制率无明显相关性(均P＞0.05)。见表2。

表1 结肠癌原发灶和淋巴结转移灶中耐药相关因子表达(n)

2.3 结肠癌原发灶、淋巴结转移灶中P-gp、Bcl-2、Bax表达与化疗药物对肿瘤细胞抑制率的关系 在肿瘤原发灶，P-gp表达程度与5-FU、VCR、PTX、VP-16对肿瘤细胞的平均抑制率均呈负相关(r= －0.287 8，P=0.047 3;r= －0.337 6，P=0.018 9;r= － 0.358 2，P=0.012 4，r= － 0.445 0，P=0.001 5);在转移灶中，P-gp表达程度与PTX、eADM对肿瘤细胞抑制率均具有负相关性(r=－0.367 2，P=0.010 2;r=－0.438 6，P=0.001 8)。原发灶Bcl-2表达程度与5-FU、PTX、MMC的抑制率呈负相关(r=－0.523 6，P＜0.001;r=－0.326 8，P=0.023 4;r= －0.305 2，P=0.034 9)，转移灶Bcl-2表达程度则与HCPT、PTX、L-OHP、eADM的抑制率均具有负相关性(r= －0.322 4，P=0.025 4;r= －0.400 8，P=0.005;r= －0.515 2，P ＜0.001，r= －0.545 0，P ＜0.001)。原发、转移灶中P-gp、Bcl-2表达与药物抑制率均未发现具有统计学意义的正相关(均P＞0.05)。在肿瘤原发灶，Bax表达程度与5-FU、VP-16对肿瘤细胞的平均抑制率均呈正相关(r=0.306 8，P=0.033 9;r=0.485 0，P=0.000 47，均 P ＜0.05);在转移灶中，Bax表达程度与CDDP、L-OHP、eADM对肿瘤细胞抑制率均具有正相关性(r=0.301 2，P=0.0375;r=0.4228，P=0.002 76;r=0.468 6，P=0.000 8)。

表2 10种药物对原发灶与淋巴结转移灶肿瘤细胞的抑制率(%，x±s)

3 讨论

研究表明，结肠癌细胞对化疗药物的抵抗是普遍现象，且结肠癌对大多数化疗药物的耐药性较胃癌更高〔3，4〕。本研究也显示，10种常用化疗药物除PTX外，大多数药物对肿瘤细胞的抑制率均在40%以下，说明结肠癌细胞对化疗药物确存在原发性MDR。

由于结肠肿瘤切除后复发的根源是残留和/或转移灶，而其在肿瘤演进过程中，不同的细胞亚群在诸多细胞学特性包括对化疗药物敏感性方面将发生基因或大分子改变。这种MDR异质性变化包括转移灶肿瘤细胞与原发灶相比在药敏性和MDR相关因子表达方面的改变。本研究中8/10种化疗药物对原发灶和转移淋巴结肿瘤细胞的抑制率并不一致，仅PTX、eADM对两种组织肿瘤细胞的抑制率无明显差异，证实化疗药敏性在两种组织中存在差异，以原发灶药敏性结果预测化疗效果并确定化疗药物是不准确的。在MDR相关因子中，P-gp的药物外排途径是目前认为导致肿瘤MDR的最重要机制〔3〕。Bcl-2和Bax则是新型的耐药相关蛋白，可以通过调控肿瘤细胞的凋亡参与MDR，其中Bcl-2为重要的凋亡抑制蛋白，可通过多种途径抑制凋亡而导致MDR〔5，6〕。Bax作为促凋亡蛋白主要通过抑制Bcl-2的活性而使凋亡易于发生〔7〕。Bax与Bcl-2有同源性，可拮抗Bcl-2，起促进细胞凋亡的作用。Bcl-2与Bax结合，形成Bcl-2/Bax异二聚体，两者的比值决定了细胞接受调控信号后存活与否〔8〕。本研究显示，P-gp、Bax在结肠癌转移灶中表达强度更高，且具有正相关性，说明结肠癌在转移过程中MDR异质性变化可能有一定规律可循，但仅检测原发灶的P-gp、Bax不能准确反映转移灶的表达情况;转移灶Bcl-2表达减弱也证实了MDR的异质性变化特点。同时从各因子的相关分析可以看出，原发灶Bcl-2和Bax有相关性，而转移灶肿瘤细胞则失去了这种相关，这可能是由于肿瘤细胞异质性变化造成Bcl-2和Bax在转移灶中表达比例进一步失调。这些结果为肿瘤切除后开展针对淋巴结转移灶的化疗提供了理论依据。

关于结肠癌MDR因子表达与化疗药敏性的关系研究尚少。本研究显示，9/10种化疗药物对原发灶或转移淋巴结肿瘤细胞的抑制率与至少一种MDR因子表达相关。原发灶中P-gp表达程度与5-FU、VCR、PTX、VP-16对肿瘤细胞的平均抑制率均呈负相关;在转移灶中，P-gp表达程度则与PTX、eADM的肿瘤细胞抑制率有负相关性。对Bcl-2的检测显示，原发灶与Bcl-2表达有负相关性的药物为5-FU、PTX、MMC，而转移灶则为HCPT、PTX、L-OHP、eADM。Bax表达强度在原发灶与5-FU、VP-16对肿瘤细胞的平均抑制率呈正相关，在转移灶则随CDDP、L-OHP、eADM抑制率升高而增强。这表明结肠癌中P-gp、Bcl-2、Bax表达确与肿瘤细胞MDR有一定关系，联合检测这3种因子在转移灶的表达对化疗药敏性预测及化疗方案选择有一定意义。但目前关于转移灶MDR异质性表达的机制及逆转策略的研究尚处于起步阶段，开展结肠癌转移灶MDR的实验及临床研究以指导针对淋巴结转移灶的辅助化疗及MDR的逆转还需进一步研究。

1 韩 杰，檀碧波，王安峰，等.消化道肿瘤淋巴结转移灶P-gp、GST-π和凋亡抑制蛋白表达的特点〔J〕.中华外科杂志，2009;47(2):106-8.

2 檀碧波，路红梅，韩 杰，等.消化道肿瘤淋巴结转移灶体外化疗药敏性的变化及其意义〔J〕.中国普通外科杂志，2009;18(4):340-2.

3 Xia Z，Zhu Z，Zhang L，et al.Specific reversal of MDR1/P-gp-dependent multidrug resistance by RNA interference in colon cancer cells〔J〕.Oncol Rep，2008;20(6):1433-9.

4 韩 杰，檀碧波，吕炳蓉，等.胃癌与大肠癌原代细胞培养化疗药物敏感性的对比〔J〕.中华普通外科杂志，2008;23(6):464-5.

5 Cory S，Huang DC，Adams JM.The Bcl-2 family:roles in cell survival and oncogenesis〔J〕.Oncogene，2003;22(53):8590-607.

6 Bray K，Chen HY，Karp CM，et al.Bcl-2 modulation to activate apoptosis in prostate cancer〔J〕.Mol Cancer Res，2009;7(9):1487-96.

7 Hossein A，Kamran G，Noorieh S，et al.Comparison of two score systems in Bcl-2 and Bax protein expression in invasive ductal carcinoma of breast and relation with oestrogen and progestrone receptors〔J〕.Breast J，2009;15(3):310-2.

8 Rashmi R，Kumar S，Karunagaran D.Human colon cancer cells lacking Bax resist curcumin-induced apoptosis and Bax requirement is dispensable with ectopic expression of Smac or downregulation of Bcl-XL〔J〕.Carcinogenesis，2005;26(4):713-23.