黄蘑多糖对H22荷瘤小鼠肿瘤生长及其VEGF表达的影响

朱惠彬 ，朱顺星 ，程 纯

1.南通大学医学院研究生院，江苏南通 226001；2.南通大学医学院实验动物中心，江苏南通 226001；3.南通大学，江苏南通 226019

目前化学治疗是肿瘤治疗中不可缺少的方法之一，然而化学治疗常引起患者免疫系统抑制、感染、胃肠道反应等多种并发症，甚至加速患者的死亡[1]。环磷酰胺虽然是临床常用的化疗药物，但能抑制免疫系统，干扰淋巴细胞的增殖。所以，抗肿瘤药物的研究不仅要强调能有效杀灭瘤细胞，更要注意积极调动患者自身的免疫功能。黄蘑（huangmo），学名亚侧耳（hohenbuehelia serotina），俗称冻蘑、元蘑，为侧耳科侧耳属的低温型野生大型食用菌，其多糖是目前抗肿瘤研究的热点。已有研究显示，黄蘑多糖提取物具有提高免疫力的作用[2]，并能抑制H22、S180、艾氏腹水瘤[3]。本实验通过建立小鼠体内移植性肝癌模型，对黄蘑多糖提取物抑制H22荷瘤小鼠的肿瘤生长进行实验研究，并对其抗肝癌的作用机制进行初步探讨，现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 瘤细胞株与实验动物

肝癌H22细胞株由中国典型培养物保藏中心提供。6～8周龄 BALB/c 小鼠 48 只，雌雄各半，体重（20±2）g，由南通大学医学院实验动物中心提供，实验室常规饲养3 d。

1.2 试剂与仪器

黄蘑多糖提取物（β-D-半乳-葡聚糖苷，分子量35000，由南通大学医学院免疫学实验室提供），环磷酰胺粉剂（江苏恒瑞制药有限公司，国药准字 H32020857，批号：09012421），VEGF兔抗小鼠多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司，临用前用PBS按1∶50稀释。二步法免疫组化检测试剂盒：GBICO公司），DAB工作液（北京中山生物技术有限公司），低温冷冻切片机（Leica公司），正、倒置显微镜（Olympus公司），图象分析系统（Leica公司），恒温水浴锅（Pharmacia公司），电热恒温干燥箱（江苏海门恒昌仪器厂），YJ-875医用净化工作台（苏州净化设备厂），超低温冰箱（德国JOUAN公司）。

1.3 模型建立与处理

培养H22细胞至对数生长期，每只小鼠左腋皮下以5×106个/ml的瘤细胞悬液接种0.2 ml，连续观察一周，造模成功后将小鼠随机分为6组，每组8只，其中，正常组和模型组给予生理盐水0.2 ml/d，环磷酰胺组（CTX组）给予环磷酰胺0.01 g/（kg·d），黄蘑多糖低、中、高剂量组分别给予黄蘑多糖0.02、0.10、0.50 g/（kg·d），给药体积均为每只 0.2 ml/d，给药途径均为灌胃给药，连续给药12 d。

1.4 抑瘤率、免疫指标及VEGF组织学检测

停药次日将小鼠颈椎脱臼处死，称取体重；眼球取血，以EDTA抗凝，倒置显微镜下计数有核细胞数目；剥离脾脏、胸腺、瘤块分别称重，计算脾指数、胸腺指数和抑瘤率。脾指数=脾重×103/体重，胸腺指数=胸腺重×103/体重，按平均瘤重计算抑瘤率，抑瘤率 （%）=[（模型组平均瘤重-给药组平均瘤重）／模型组平均瘤重]×100%。取瘤组织做冰冻切片免疫组化检验VEGF的表达情况。

1.5 染色评分与VEGF表达的判定

VEGF阳性染色的标准：细胞浆中出现棕色颗粒。先在低倍镜下观察阳性细胞的分布情况，每例切片随机选取5个视野，再以200×高倍镜计数，每个视野取100个细胞的阳性细胞数。参考Fromowitz综合计分法[4]进行染色评定：总分=阳性细胞比例分值+染色强度分值。阳性细胞比例评定标准：阳性细胞数＜5%为0分；5%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；＞75%为4分。染色强度评定标准：阴性染色为0分；染色虽弱但明显强于阴性对照为1分；染色强度中等为2分；强染色为3分。将两种评分相加，结果分为 4 个等级：0～1 分为（-）；2 分为（+）；3～4 分为（++）；5～7分为（+++）。按综合评分的等级来评价各组切片的指标变化情况，染色评分值越高，则对应的VEGF表达水平越高。

1.6 统计学方法

实验数据采用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（）表示，行方差分析和LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄蘑多糖的抑瘤作用及对免疫器官的影响

黄蘑多糖各组的肿瘤重量均低于模型组，其中，中、高剂量组的抑瘤效果显著（P＜0.05）。CTX组虽然肿瘤重量明显低于黄蘑多糖各组（P＜0.01），但也显示了极强的毒副作用，小鼠一般状态极差，神情呆滞，行带迟缓，给药期间死亡2只。相反，黄蘑多糖各组相对CTX组，小鼠精神状态较好，活动较灵活，脾指数、胸腺指数、有核细胞数均显著高于CTX组（P＜0.01），同时也高于模型组（P＜0.05），显示了较好的免疫增强作用。见表1、2。

表1 黄蘑多糖对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用（）

表1 黄蘑多糖对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用（）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与 CTX 组比较，#P＜0.05

正常组（n=8）模型组（n=8）CTX 组（n=8）黄蘑多糖低剂量组（n=8）黄蘑多糖中剂量组（n=8）黄蘑多糖高剂量组（n=8）组别 取材时体重（g）22.6±0.824.8±2.622.0±2.622.4±2.322.0±1.922.7±1.6瘤重（g）02.1±1.50.5±0.2**1.4±1.1#0.9±0.3*0.7±0.8*抑瘤率（%）00.076.233.357.166.7

表2 黄蘑多糖对H22荷瘤小鼠免疫系统的影响（）

表2 黄蘑多糖对H22荷瘤小鼠免疫系统的影响（）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与 CTX 组比较，##P＜0.01

正常组（n=8）模型组（n=8）CTX 组（n=8）黄蘑多糖低剂量组（n=8）黄蘑多糖中剂量组（n=8）黄蘑多糖高剂量组（n=8）组别 脾指数（mg/g）48.9±19.249.4±13.617.0±6.2**55.2±13.8*##55.7±9.1*##56.1±11.0*##胸腺指数（mg/g）22.4±5.620.4±7.37.5±6.7**21.5±6.5##24.4±3.5*##27.1±6.9*##有核细胞数（109/L）2.7±1.02.6±1.41.2±0.2**3.5±1.5*##3.7±1.2*##4.3±0.9*##

2.2 黄蘑多糖对瘤组织VEGF表达的影响

黄蘑多糖各组的VEGF表达率显著低于模型组（P＜0.01），黄蘑多糖低、中剂量组VEGF的表达与CTX组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），高剂量组与CTX组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），显示了较强的抗肿瘤血管生成能力。见表3。

表3 黄蘑多糖对小鼠瘤组织VEGF表达的影响（，分）

表3 黄蘑多糖对小鼠瘤组织VEGF表达的影响（，分）

注：与模型组比较，**P＜0.01；与 CTX 组比较，#P＜0.05

模型组（n=8）CTX 组（n=8）黄蘑多糖低剂量组（n=8）黄蘑多糖中剂量组（n=8）黄蘑多糖高剂量组（n=8）组别 给药量（g/kg）-0.010.020.100.50样本例数 阳性例数8888888888染色评分13.2±1.52.9±2.8**5.9±3.4**#4.1±2.8**#3.5±1.7**

3 讨论

目前医学界关于肿瘤的形成发展有种较成熟的观点：肿瘤的恶性增殖、转移必须依赖持续和广泛的血管生成。而VEGF是肿瘤中主要的血管生长因子，诱导肿瘤内形成管壁不完整的新生血管，一方面为肿瘤生长提供血液供应；另一方面，不完整的新生血管增加了肿瘤细胞远处转移的机会，在肿瘤发展中不仅与肿瘤生长和病理分级有关，还影响肿瘤的预后[5]。肝细胞癌作为多血管性肿瘤，其生长及转移均与血管新生有关，已证实其VEGF呈高表达，且VEGF不仅通过调节血管新生促进肿瘤生长，还可能直接作用于肿瘤细胞[6]。有文献报道[7]，中草药的提取成分可以降低瘤组织内VEGF的表达。

本实验结果显示，黄蘑多糖对H22移植性肝细胞癌的生长具有一定的抑制作用，且其抗瘤作用与给药剂量呈一定的量效关系，同时黄蘑多糖组的免疫器官重量较CTX组和模型组显著提高，有核细胞数也明显高于CTX组和模型组（P＜0.01 或 P＜0.05），而马岩等[8]的研究显示，黄蘑多糖的提取物对辅助环磷酰胺治疗肿瘤具有一定的减毒增效作用，其抗瘤效果优于单独使用CTX或黄蘑多糖。此外，本实验通过检测瘤组织VEGF的表达情况，证实黄蘑多糖各组VEGF的表达显著低于模型组，并呈一定的浓度依赖性（P＜0.05）。因此，笔者推测黄蘑多糖的抑瘤效应存在多个作用靶点：①作为生物反应调节剂调节机体自身免疫。②抑制肿瘤组织中VEGF的生成，进而抑制血管内皮细胞的增殖、迁移，影响肿瘤血管的生成，减少瘤组织血供。③可能存在其他如促进细胞凋亡、抑制细胞的增殖、干扰细胞信号传导等途径。鉴于黄蘑多糖在辅助抗肿瘤治疗上具有一定的药用价值，值得进一步研究。

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