中药黄连结肠定位包衣片在家兔体内的药物动力学研究

王建明，王宇，薛红梅，高珊珊

(1.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

中药黄连结肠定位包衣片是以黄连提取物为原料药，Eudragit(优特奇)水分散体为包衣材料，根据pH敏感－时间控释双重机理，利用多层包衣技术制备的新型中药结肠靶向给药系统［1－3］。其理想的体内代谢效果是在降低血药浓度的同时，提高结肠局部药物浓度，从而达到对结肠疾病产生较好的局部治疗作用和提高生物利用度的效果［4］。本实验主要是通过对比黄连结肠定位包衣片和黄连提取物未包衣片芯在生物体内的释药特征，从而对黄连结肠定位包衣片的结肠定位效率作出评价。

1 实验材料

1.1 试药

黄连结肠定位包衣片(自制，规格:280mg/片，代号为T);未包衣黄连载药片芯(自制，规格:280mg/片，代号为R);盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号713－8702);磷酸二氢钾为分析纯(天津市津东天正精细化学试剂厂);乙腈为色谱纯(Dikmapure公司);其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Waters2487型高效液相色谱仪;KDC－160HR高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司);XW－80A漩涡混合器(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司);KQ－300VDE型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);AG－135型电子分析天平(瑞士 METTLER－TOLEPO公司);微量取样器(上海大龙医疗设备有限公司)。

1.3 受试动物

新西兰健康大耳白兔6只，雌雄各半，体质量1.5～2.5kg，黑龙江中医药大学 GLP实验动物中心提供。

1.4 药代动力学分析软件

WinNonlin 5.2版药代动力学分析软件。

2 实验方法与结果

2.1 给药及样品采集

将6只家兔随机等分成两组，每组3只。受试制剂组(T)，参比制剂组(R)。两种制剂的给药剂量均为3片/只，按每日单剂量给药。为确保实验结果的准确性，灌胃时应防止家兔将包衣片嚼碎。

受试家兔给药前禁食12h，自由饮水。给药前先自耳缘静脉采取空白血液，以作空白和回收试验用。按照给药方案设计的给药方法，分别单次口服受试制剂3片或参比制剂3片。两组家兔均在给药后1，2，3，4，5，5.5，6，6.5，7，8，10，12，14，16，18，20，22，24h 于耳缘静脉取血约2mL置于肝素钠处理过的负压玻璃管中，胶塞密封，3 000r/min离心15min，分离血浆，移取上清液于离心管中，标注试验号及采血时间，血样放置于冰箱冷冻室中－20℃保存，以备处理分析。

2.2 盐酸小檗碱在生物样品中的测定方法与评价

2.2.1 血浆样品预处理方法的比较

血浆样品进行药代动力学研究前均需沉淀除去蛋白，本试验分别对常用蛋白沉淀剂高氯酸、甲醇和乙腈的沉淀效果进行了考察。

精密吸取浓度为18μg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液50μL于离心管中，水浴40℃挥干溶剂，加入家兔空白血浆100μL，再加入500μL的甲醇，涡旋振荡混合1min，以3 000r/min离心15min，取上清液，N2吹干，甲醇定容至0.5ml，经0.45μm的微孔滤膜过滤后，进样20μL，重复2次，利用当日标准曲线计算药物浓度。同法分别用高氯酸和乙腈处理血浆样品。结果见表1。

表1 血浆样品的预处理

实验结果表明，用高氯酸和乙腈沉淀处理蛋白时，盐酸小檗碱的检测被杂质峰所干扰，样品的峰形不好，回收率过低。而用甲醇沉淀处理蛋白时，样品的峰形很好，回收率也符合药物动力学的研究要求，因此用甲醇作为蛋白沉淀剂处理血浆样品更适合本实验。

2.2.2 血浆中药物含量测定方法的建立

2.2.2.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil(TM)C18柱(4.6mm×200mm，5μm);流动相:乙腈 －磷酸二氢钾(30∶70);检测波长:265nm;流速:1.0mL/min;柱温:25℃;进样量:20μL。

2.2.2.2 标准溶液的配制

精密称取盐酸小檗碱对照品18mg置于100ml的容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到0.18mg/ml的对照品贮备液，精密移取盐酸小檗碱对照品贮备液1mL，以甲醇定量稀释配制成1.8μg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液，置于4℃冰箱中避光冷藏备用。

2.2.2.3 标准曲线的制备

精密吸取1.8μg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液40μL，160μL，320μL，400μL，800μL，置于离心管中，于40℃水浴挥干溶剂后，分别精密加入空白血浆1 000μL，涡旋振荡混合1min后，按血浆样品预处理方法进行处理。利用高效液相分析测定，进样量为10μL。以血药浓度为横坐标(X)，色谱峰面积值为纵坐标(Y)进行线性回归，得浓度与峰面积的标准曲线，回归方程为:Y=20 624X+158.67，相关系数r2=0.999 8。

结果表明，盐酸小檗碱在0.072～1.44μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.2.4 专属性考察

将空白血浆、样品血浆、对照品溶液和空白血浆加对照品均按血浆样品预处理方法进行处理，在上述色谱条件下进样各20μL测定，所得色谱图见图1。

图1 血浆样品的专属性

由图可见，在上述色谱条件下，盐酸小檗碱的保留时间均为11min左右，且分离度良好，血浆内源物质不干扰盐酸小檗碱的测定，因此本方法具有良好的专属性。

2.2.2.5 灵敏度试验

配 制 浓 度 为 0.007 2，0.072，0.288，0.432，1.44μg/ml血浆对照品溶液，按标准曲线制备方法处理进样，重复3次，测得各质量浓度盐酸小檗碱的峰面积与噪音峰面积，按色谱峰信噪比S/N≥3时盐酸小檗碱的质量浓度为最低检测质量浓度，结果得出盐酸小檗碱最低检测质量浓度为0.007 2μg/ml。

2.2.2.6 回收率试验

方法回收率:取空白血浆100μL，加入盐酸小檗碱对照品溶液，配制高、中、低三种不同浓度的盐酸小檗碱血浆样品(浓度分别为 72、36、7.2μg/mL)，按照血浆样品的处理方法和测定方法操作，进样分析，由当日标准曲线求出各样品的浓度，并与加入浓度相比较，计算平均方法回收率。结果见表2。

绝对回收率:按照方法回收率实验方法配制高、中、低3种浓度的盐酸小檗碱血浆样品(浓度分别为72、36、7.2μg/mL)，血浆样品经预处理后，进样分析，将结果与同等浓度的标准品直接进样分析测得的峰面积相比较，计算平均绝对回收率。结果见表2。

2.2.2.7 精密度试验

取空白血浆100μL，加入盐酸小檗碱对照品溶液，配制成高、中、低三种不同浓度的盐酸小檗碱血浆样品(浓度分别为 72、36、7.2μg/mL)，按照血浆样品的处理方法和测定方法，进样分析同一样品溶液平行操作5次，同一批样品溶液连续测定5天，由当日标准曲线求出各样品的浓度，求得日内及日间精密度。结果见表2。

表2 回收率与精密度测定结果 (n=5)

实验结果表明，该研究方法在高、中、低三个浓度水平的方法平均回收率大于80%;绝对平均回收率大于90%;血浆样品的日内、日间的精密度RSD皆小于5%，满足生物样品的测定要求，能够用于受试制剂和参比制剂的体内药物动力学研究。

2.2.2.8 稳定性试验

血浆样品按血浆样品预处理方法和测定方法，在48h之内的不同时间点进样分析，结果盐酸小檗碱峰面积的RSD值为3.68%，表明血浆样品至少在48h内稳定。

2.3 家兔体内药动学研究

将6只家兔随机分为两组，分别采用黄连提取物结肠定位包衣片和未包衣片芯口服给药后，在不同时间点采血，按血浆样品预处理的方法和样品测定方法，通过反相高效液相色谱RP－HPLC方法测定盐酸小檗碱的血药浓度。得到平均血药浓度－时间曲线见图2及图3;所得数据用药动学软件WinNonlin 5.2进行数据拟合，结果表明，黄连结肠定位包衣片和未包衣片口服后在家兔体内的药代动力学参数均符合一室模型，主要动力学参数见表3。

图2 家兔口服黄连未包衣片后的血药浓度－时间曲线

图3 家兔口服黄连包衣片后的血药浓度时间曲线

表3 参比制剂与受试制剂主要药动学参数的比较

3 讨论

盐酸小檗碱为中国药典收载的常用抗菌药，在治疗肠炎方面疗效显著，副作用小。但如果作为治疗结肠疾病的药物，到达病灶处的药量过低严重影响了盐酸小檗碱的生物利用率［5］。而黄连的结肠定向包衣片拥有直接作用结肠，避免胃酸、酶类破坏，降低血药浓度，延长作用时间，减少毒副作用等特点［6－8］。因此为解决其生物利用度低的问题提供一个良好的方案。

本试验血浆样品成分比较复杂，干扰物多，待测药在血浆中的含量很低，不经预处理往往不易被仪器检出。因此对不同方法处理的样品进行了对比，结果表明，本试验中采用甲醇作为蛋白沉淀剂比高氯酸和乙腈的沉淀效果更好。

本研究显示，黄连结肠定位包衣片与未包衣片在家兔体内药物动力学行为差异显著，未包衣片芯口服后0.5h即可检测到药物，Tmax为3h，而结肠定位包衣片在口服5h后才可检测出药物，Tmax为8h，这与体外时滞相比略有延迟。表明受试制剂在胃内和小肠部的释放量少，降低了胃部胃酸的降解和小肠吸收的肝首过效应，提高了生物利用率。结肠定位包衣片的AUC值仅为普通片的30.1%，其Cmax值仅为普通片的22.1%，这说明吸收进入血液循环的药量显著降低，从而使大部分药物停留在结肠局部，有利于结肠局部病变部位的治疗。

本实验表明，黄连结肠定向包衣片可以将药物输送到结肠部位达到结肠定位靶向效果，且效果明显，可以显著提高了药物的生物利用率。

［1］ 齐美玲，吴德政.结肠给药系统的设计及体内评价［J］.中国临床药理学杂志，2000，16(2):150 －154.

［2］ Goto T，Tanida N，Yoshinaga T.Pharmaceutical design of a novel colon－targeted delivery system using two－layer－coated tablets of three different pharmaceutical formulations，supported by clinical evidence in humans［J］.Journal of Controlled Release，2004，97(1):31 － 42.

［3］ Patel MM，Shah TJ，Amin AF，et al.Design，development and optimization of a novel time and pH－dependent colon targeted drug delivery system［J］.Pharmaceutical Development and Technology，2009，14，(1):56－72.

［4］ 任国莲，张淑秋.口服结肠定位给药系统的研究进展［J］.中国药物与临床，2006，6(1):8 －10.

［5］ 刘欣，薛红梅.盐酸小檗碱结肠定位包衣片的制备工艺和体外释放研究［J］.世界科技研究与发展，2008，30(3):347 －351.

［6］ Tarnara Minko.Drug targeting to the colon with lectins and neoglycoconjugates［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2004，56(4):491－509.

［7］ 刘德文，王锦玉.给药系统的研究现状及展望［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16(10):200 －203.

［8］ 于鹤丹，刘欣，王建明.丁香提取物结肠靶向片体外释放及释放机理的研究［J］.中医药学报，2010，38(2):102 －105.