养心颗粒对犬心肌梗死后心脏局部自主神经的影响

李晶洁，于彦伟，王召军，冯薇，周亚滨

(1.哈尔滨医科大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

20年来大量的临床实践证明，心肌梗死(MI)后自主神经功能严重失调，且与患者的预后密切相关。有研究表明，MI后交感神经激活的机制与心脏局部感受器的反射控制相关，可能是MI导致来自心脏局部感受器的反射受损，使交感传出活性受到抑制，但目前对MI后心脏局部交感神经损伤及再生机制的研究很少。本研究应用免疫组织化学技术定量研究MI后心脏局部交感神经分布情况，观察中药养心颗粒对心脏局部交感神经损伤及再生过程的影响，以探讨其改善MI后自主神经功能失调的机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型的制备及分组

成年健康杂种犬21只，雌雄不拘，体质量14～22kg，随机分为假手术对照组、MI组与MI+养心颗粒组(MI后每天给予养心颗粒2.53g/kg)各7只。3%戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉，气管插管接人工呼吸机。在无菌条件下，沿左侧第4肋间开胸，在冠状动脉前降支分出第1对角支的近端，用0号线结扎冠状动脉前降支造成左心室前侧壁心肌梗死。假手术组开胸不结扎冠脉。术后三组动物均正常饮食喂养4周。

1.2 养心颗粒药物制备 将黄芪50g，人参15g，茯神15g，茯苓 15g，半夏 15g，当归 15g，川芎15g 等 13 味中药，加10倍量水浸泡2h，煎煮2h，过滤后加8倍量水，煎煮1.5h，过滤后加6倍量水煎煮1h，过滤。将3次滤液合并，减压浓缩至相对密度1.3(60℃)，每克浸膏含生药 2.86g。按 2.53g/kg喂食，每日 1次，连续2周。

2 免疫组化测定交感神经重构情况

2.1 标本的取材及固定

活体快速取下心脏，以房室沟为界剪去心房及心底部其它组织，在左心室梗死区旁距梗死边缘约0.5cm的非梗死区取材，取材按左室长轴方向，取材后立即投入4%多聚甲醛固定液中，固定24～48h。石蜡包埋、切片，片厚4～5μm。每例测两张切片。

2.2 交感神经支配密度的测定方法

心肌中交感神经支配区域为洛氨酸羟化酶(TH)阳性染色区域，TH染色阳性神经纤维由Motic Images Advanced 3.2软件及专用显微镜组成的计算机图像处理系统进行检测。每张玻片在40×物镜下进行检测。依据阳性免疫反应的图像选择合适的分割阈值，实现单点生长分割。以人机交互方式测定梗死区旁非梗死区的神经纤维密度。神经密度通过TH阳性纤维在选区中所占的面积表示(um2/mm2)，其中阳性纤维的面积以um2表示，选取面积以mm2表示。每张玻片中，6个包含最多神经结构视野的神经密度的平均值代表该玻片的神经密度。

2.3 数据处理及统计学检验

所有数据输入计算机，应用SPSS 11.5软件分析。结果以均值±标准差表示，两组之间的差异比较应用t检验，两样本率的比较采用χ2检验。其中P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。

3 结果

假手术对照组中，心肌细胞之间均可见TH免疫染色阳性的神经纤维分布，神经纤维主要分布在心内膜下、心外膜下及血管旁，其走行与心肌细胞方向一致。

心肌梗死组中，在两只犬检测到酪氨酸羟化酶免疫染色神经纤维密度明显增高区，显示该局部神经增生活跃。该组其它各犬检测到的神经密度亦明显高于对照组，且神经走行紊乱。

心肌梗死+养心颗粒组中，神经密度虽高于对照组，但较心肌梗死组密度明显降低，差异有统计学意义，且在该组中未检测到神经纤维密度异常增高区。见表1。

表1 各组犬梗死灶周边区交感神经支配密度(um2/mm2，±s)

表1 各组犬梗死灶周边区交感神经支配密度(um2/mm2，±s)

注:相同部位与对照组比较，*P＜0.01;相同部位与心肌梗死组比较，#P ＜0.01。

组别 络氨酸羟化酶正常对照组2 917.71 ±190.99心肌梗死组 3 779.86 ±286.57*心肌梗死 +养心颗粒组 3 134.48 ±265.27#

4 讨论

近年自主神经逐渐被认识到是心律失常发生和持续的一个重要因素，心律失常与自主神经功能紊乱有着必然的联系，主要证据有:大多数心源性猝死存在昼夜差异，其发病高峰时间恰与交感神经兴奋性增高的时间相吻合，且精神因素是强烈的诱发条件。大规模临床实验证明，β受体阻滞剂可大大减少心肌梗死患者的猝死率［1］，这为自主神经维持心肌电活动稳定性所起的重要作用提供了有力佐证。但过去对这方面的认识多集中在交感神经兴奋增加心肌组织的易损性上，近年发现，心肌梗死后心脏局部自主神经发生复杂的结构和功能改变，很可能通过影响心脏电生理稳定性参与功能性折返和室性心律失常。

有研究发现，交感神经对缺血的耐受性很差。在不伴有心肌梗死的冠心病病人中，自主神经已存在分布异常现象［2］。动物实验中，由冠脉狭窄造成的心肌顿抑可引起自主神经的分布明显减少［3］，这说明神经比心肌细胞对缺血的耐受性更差，如果缺血持续40min以上，心肌的神经就会发生结构变化。MI后1～6周(尤其3～4周)，梗死区周边去甲肾上腺素含量先是减少后有所恢复［4］，这说明MI后心脏局部交感神经有动态变化。酪氨酸羟化酶(TH)是儿茶酚胺生物合成的限速酶，交感神经的末梢轴索中含有大量的TH，它的存在标志着交感神经结构及功能的完整。本研究通过应用抗TH的免疫组织化学方法，检测心脏中交感神经分布，证明MI组与正常对照组相比存在显著的交感神经分布不均现象，特别在2只犬梗死区周边的非梗死区检测到交感神经密度显著增高区，呈丛状分布，神经排列不规则，这说明该部位有交感神经再生现象。有研究表明，在体外交感神经培养时，慢性神经刺激能够导致TH表达增强、儿茶酚胺产生增加［5－6］。我们通过在体研究证明，心肌梗死后心肌中存在交感神经再生现象。养心颗粒是以益气养心安神为原则组成的中药复方制剂［7］，在多年的临床工作中，应用养心汤作为主方进行加减治疗不稳定型心绞痛，取得了较好的疗效，同时还降低心律失常的发生机率。本研究应用养心颗粒干预心肌梗死犬，发现其有抑制心肌梗死后心脏局部交感神经过度再生机制，从而为其降低心律失常发生率提供理论依据。

［1］ Li X，Huang CX，Jiang H，et al.The beta － adrenergic blocker carvedilol restores L－type calcium current in a myocardial infarction model of rabbit［J］.Chinese Medical Journal，2005，118:377 － 382.

［2］ Bulow HP，Stahl F，Lauer B，et al.Alterations of myocardial presynaptic sympathetic innervation in patients with multi－vessel coronary artery disease but without history of myocardial infarction［J］.Nucl Med Commun，2003，24(3):233 －239.

［3］ Luisi AJ Jr，Fallavollita JA，Suzuki G，et al.Spatial inhomogeneity of sympathetic nerve function in hibernating myocardium［J］.Circulation，2002，106(7):779 －781.

［4］ Hartikainen J，Kuikka J，Mantysaari M，et al.Sympathetic reinnervation after acute myocardial infarction［J］.Am J Cardiol，1996，77:5 －9.

［5］ 蔡文琴，王伯沄.实用免疫细胞化学与梭酸分子杂交技术［M］.成都:四川科学技术出版社，1994:222－225.

［6］ Li W，Knowlton D，Woodward WR，et al.Regulation of noradrenergic function by inflammatory cytokines and depolarization［J］.J Neurochem，2003，86:774 －783.

［7］ Raynaud B，Clarous D，Vidal S，et al.Comparison of the effects of elevated Kions and muscle－conditioned medium on the neurotransmitter phenotype of cultured sympathetic neurons［J］.Dev Biol，1987，121:548－558.