银消颗粒对小鼠细胞因子影响的实验研究

刘拥军，王璐，张磊，张健

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

中药银消颗粒由大黄，苦参，黄芩，连翘，玄参等组成，在临床用于血热湿毒内蕴型银屑病的治疗。本课题通过研究其对银屑病小鼠模型TNF－α、IL－18和IL－10的影响，以免疫学为切入点，探讨中药银消颗粒防治银屑病的作用机制。

1实验材料

1.1 受试药物

银消颗粒(江阴天江药业有限公司，批号0806119);甲氨喋呤(上海医药有限公司信谊制药总厂，国药准字H31020644);生理盐水(哈尔滨三联药业有限公司，国药准字H23020612)。

1.2 实验动物

昆明种小白鼠，哈尔滨医科大学第三医院实验动物中心提供。

1.3 主要试剂

(TNF－α)肿瘤坏死因子－α ELISA试剂盒、白介素－10(IL－10)ELISA检测试剂盒(上海森雄科技实业有限公司);白介素－18(IL－18)ELISA检测试剂盒(美国R＆D Systems进口分装)。

1.4 主要仪器

CO2培养箱(德国 Heraevs);酶标仪(BIORAD680中国香港);超净工作台(SM－CJ－IT苏州净化设备制造公司);紫外分光光度计(上海分析仪器厂)。

2实验方法［1］

2.1 动物分组

取昆明种小白鼠50只，雌雄各半，体质量18～22g，随机分为5组。生理盐水阴性对照组(NS)，甲氨喋呤阳性对照组(MTX)，银消颗粒分3个剂量组(低银、中银、高银)，为治疗组。

2.2 动物的给药剂量

生理盐水阴性对照组为0.18g/kg(0.2ml/10g)，甲氨喋呤阳性对照组为0.001g/kg(0.2ml/10g)，银消颗粒各浓度组为 0.65g/kg、1.3g/kg、2.6g/kg(0.2ml/10g)。

2.3 动物造模

把各组动物分别称体质量，按给药剂量，NS组、MTX组和中药各组用灌饲器灌胃给药，均每天1次，连续用药14天。在用药期间，每间隔2天称量体质量1次，以调整给药量。

2.4 实验药物制备

用重蒸水1∶20稀释;底物工作液配制:使用前将OPD片放入底物稀释液中溶解，每片加液5ml;标准品液配制:使用前每管中加入蒸馏水200μl溶解后即可。

2.5 收集上清

脱颈处死小鼠，酒精消毒。腹腔注入含5%小牛血清的Hank`s(5%NBS－HBSS)，轻揉腹部吸出腹腔液体，1 500r/min离心8min，弃上清。将腹腔细胞用含10%小牛血清1640液(10%NBS－1640)配成2×109个/L悬液，加入到24孔培养板，每孔1ml，置37℃5%CO2培养箱中培养2h。每孔用5%NBS－HBSS洗3次，贴壁细胞为巨噬细胞单层。每孔加入终浓度为10ug/ml的LPS 1ml，以激活巨噬细胞，培养4h后，收集上清，置－20℃冰箱保存待测TNF－α。另加入10%NBS－1640 1ml，继续培养至 24h，3 000r/min 离心10min，收集上清，置－20℃冰箱保存待测IL－18。

在超净工作台于无菌条件下，取各组小鼠脾脏，用Hank`s液常规制备脾细胞悬液，用完全RPMI 1640培养液将细胞浓度调到1×1010个/L。铺板加样，于96孔细胞培养板中，每孔加入脾细胞悬液100ul，再加入100ul含5mg/L(终浓度)ConA的培养液，置37℃5%CO2孵箱孵育，培养48h收集上清。采集的上清应尽早检测，2～8℃保存 1天;需更长时间须冷冻(－20℃)保存，避免反复冻融。

2.6 指标测定与计算

在酶标仪492nm、450nm处测吸光值，所有OD值都应减除空白值后再行计算。使用SPSS 12统计学分析软件，单因素方差分析，t检验。

3结果见表1～表3。

表1 银消颗粒对小鼠TNF－α的影响

表2 银消颗粒对小鼠IL－18的影响

表3 银消颗粒对小鼠IL－10的影响

4讨论

4.1 银消颗粒对TNF－α的影响

肿瘤坏死因子是银屑病免疫学发病机制中重要的细胞因子，在银屑病皮损处炎细胞的浸润方面起重要作用。银屑病皮损表皮的T细胞可产生TNF－α，皮损处角质形成细胞及内皮细胞存在TNF－α强表达，并可能在诱导P－选择素，E－选择素等黏附分子的表达方面具有重要作用，银屑病患者表皮过度增殖与TNF引起的角蛋白K6，K16，K17等基因异常表达有关。经研究发现，银消颗粒各剂量组均能显著抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF－α，中、高剂量组与MTX组比较无显著差异，低剂量组与MTX组比较有显著差异，而且随着浓度的升高抑制作用逐渐增强。说明银消颗粒具有抑制巨噬细胞产生TNF－α的功能。

4.2 银消颗粒对IL－18的影响

IL－18是一种炎性细胞因子，其结构与IL－1家族类似，原名IFN－γ诱导因子，是强有力的INF－γ诱导剂，直接作用于NK细胞，刺激INF－γ的合成。激活淋巴细胞和巨噬细胞，直接促进TNF－α的产生，IL－18在一系列免疫性疾病中发挥重要的免疫调节作用。在炎症反映中起着双向调节的作用，可调节Thl和Th2型免疫反应。IL－18活化的T细胞和NK细胞产生IFN－γ，并与IL－12协同刺激Thl型免疫应答，促进Thl型细胞增殖和IL－2分泌，抑制活化的T细胞产生IL－10。有学者研究证明［2］银屑病患者外周血血清中的IL－18水平与PASI评分呈正相关。在研究中，发现银消颗粒各剂量组可以显著抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞产生IL－18，并与MTX组比较均无显著差异，而且药物浓度的升高与抑制作用呈正相关。说明银消颗粒具有抑制巨噬细胞产生IL－18的功能。

4.3 银消颗粒对IL－10的影响

IL－10不仅抑制Th1细胞合成IFN－γ，还可抑制前炎症细胞因子的产生，影响单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞的抗原递呈能力，促进Th2型细胞因子模式的发展，调节Th1/TH2的平衡。临床上治疗银屑病的药物如糖皮质激素、卡泊三醇、维生素D3、蒽林等，可以使 IL －10 的表达显著增加［3］。Seifert等［4］认为，IL－10不直接对角质形成细胞发挥作用，而是通过对循环免疫细胞的调节效应达到抗银屑病的作用。实验研究证明，银消颗粒各剂量组可显著增强ConA诱导的小鼠T淋巴细胞产生IL－10，高、中剂量组与MTX组比较有非常显著差异，而且药物浓度的升高与促进作用呈正相关。说明银消颗粒在治疗银屑病过程中促进了IL－10的产生。

银屑病不仅有局部皮肤的病理变化特征，它的发病还与体内免疫功能的失调有关［5］。由其分泌而形成的细胞因子在病理信息传递网络中有着重要的作用，是诱导银屑病表皮动力学紊乱的重要环节。免疫学研究表明，银消颗粒抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞产生TNF－α、IL－18，促进ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞产生IL－10。但是银消颗粒对细胞因子的抑制作用具有不均衡性，对小鼠巨噬细胞产生的IL－18抑制作用最强，在低浓度时即与甲氨喋呤组无显著差异。而对TNF－α的作用稍弱，在中、高剂量时才与甲氨喋呤组无显著差异。因此银消颗粒可能通过双向调节银屑病患者的免疫功能状态，抑制Th1型细胞因子，促进Th2型细胞因子模式的发展，调节Th1/TH2的平衡，多靶点有效治疗银屑病。如何利用中药选择性诱导或调控Th1/Th2细胞的动态平衡，对进一步分析中医药治疗银屑病的机制，筛选有效的方药，进而提取有效成分有重要意义。

［1］ 朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法［M］.北京:人民军医出版社，2000:192 －231.

［2］ Pietrzak A，Lecewicz－torun B，Chodorowska G.Interleukin－18 levels in the plasma of psoriatic patients correlate with the extent of skin lesions and the PASI Score［J］.Acta Derm Venereol，2003，83(4):262－265.

［3］ Farkas A，Kemeny L，Szony BJ，et al.Dithranall upregulates IL －10receptors on the cultured human keratinocyte cell line Ha CaT［J］.Inflam Res，2001，50(1):44 －49.

［4］ Seifert M，Seerry W，berger E，et al.The antipsoriatic activity of IL －10 is rather caused by effects on peripheral blood cells than by a direct effect on human keratinocytes［J］.Arch Dermatol Res，2000，292(4):164－172.

［5］ 李志鸿，金娟.凉血解毒方治疗寻常型银屑病血热证的临床观察［J］.中医药学报，2011，39(3):135 －136.