海带硫酸多糖对胶质瘤细胞增殖的抑制作用

李 晓，徐承水，赵云峰

(1.济宁医学院药学院，山东 济宁 272013;2.曲阜师范大学 生命科学学院，山东 曲阜 273165)

海带(Laminaria japonica Aresch)是褐藻门(Phaeophyta)的一种大型海藻，它作为一种重要的海生资源，其食用与药用价值很早就为世人所知。现有研究发现从海带中提取的海带硫酸多糖(Laminaria polysaccharide sulphate，LPS)是一种特有的含有硫酸酯的天然活性多糖，具有抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、抗血栓、提高免疫力等活性［1-4］，并且细胞毒性试验表明，LPS对机体没有毒副作用［5］。为了阐明海带LPS的作用机制，并对其进一步的开发和利用，我们对LPS的体外抗肿瘤活性进行了研究。

1 材料

LPS，按文献［6］提取，纯度为29.2%，硫酸根占糖总量的41.2%，用双蒸水配成10 mg/mL的溶液，101.3 kPa(121.3℃)灭菌10 min，4℃冰箱保存。

大鼠胶质瘤细胞(C6)，中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库;DMEM，Gibco公司;胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物工程材料有限公司;胰蛋白酶，Amresco公司;谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所。

MCD-17A型CO2培养箱，日本 Sanyo公司;分光光度计，美国PE公司;Leica荧光倒置相差显微镜，德国Leica公司;FACScan型流式细胞检测仪，美国Becton Dickinson公司。

2 方法

2.1 细胞培养

C6细胞以含10%FBS的DMEM做培养基，37℃、5%CO2饱和湿度下培养，待细胞铺满瓶底时用0.25%胰酶消化，混匀后计数，按适当密度接种到特定培养器皿中。

2.2 细胞形态观察法和细胞计数法

细胞以2万个/孔的密度接种于24孔板中，培养24 h 后加药，分为对照组、LPS 50，100，200 μg/mL组。分别继续培养24，48，72 h后取出培养板，置于相差显微镜下观察其形态并拍照。后用0.25%胰酶消化，收集、离心、重悬，用台盼蓝染色法计数，观察不同浓度药物作用下对C6细胞生长的影响。

2.3 流式细胞仪检测细胞周期

细胞以约200万个/mL接种于大培养皿中，培养24 h后分为对照组、LPS组(100 μg/mL)，分别继续培养24，48 h后收集细胞，PI染色后流式细胞仪检测不同情况下的细胞周期。

2.4 GSTs测试

细胞以(9～10)×10 个/孔的密度接种于6孔板中，24 h后加药。继续培养24，48 h。分别将细胞消化后收集到干净的试管中，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液重悬，用超声波细胞粉碎仪在0℃粉碎细胞。取上清按试剂盒说明的步骤进行酶促反应和显色反应，测定412 nm波长处的吸光度值，计算酶活性。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 形态学观察

对照组细胞生长旺盛形态正常;实验组细胞变化较大，异形性增多，细胞空泡大量增多，多呈圆形。加药48 h后，细胞数量随着药物浓度的增加和时间的延长而减少，培养液中出现较多的漂浮的死细胞。见图1。

图1 LPS处理24～72 h C6细胞形态变化(200×)Fig.1 LPS-induced morphological changes of C6 cells(200×)

3.2 LPS对C6的体外生长抑制作用

LPS 50～200 μg/mL处理24 h后，对 C6体外增殖的抑制率分别为17.3%，35.1%和50.6%，与对照组比较差异显著(P＜0.05);处理48 h后，抑制率分别为55.2%，71.3%和80.6%，与对照组比较有非常显著差异(P＜0.01);处理72 h后则更加明显，抑制率分别达到92.6%，96.1%和98.9%，与对照组比较有非常显著差异(P＜0.01)。LPS对C6细胞的增殖抑制作用呈剂量时间依赖性。见图2。

3.3 流式细胞仪检测不同情况下的细胞周期分布结果

与对照组相比，LPS组G0/G1期占细胞周期的比例逐渐增加，S期占细胞周期的比例逐渐降低。见图3。

图2 LPS处理24～72 h对C6细胞的抑制率变化Fig.2 Effect of LPS on cell growth inhibition in C6 cells

3.4 GSTs活性测定结果

对照组细胞中GSTs的活性较高，加药24～48 h后与对照组相比较，LPS组的GSTs随时间和浓度依次降低，具有时间剂量依赖性，见图4。

图3 LPS处理对C6细胞周期分布的影响Fig.3 Effects of LPS on the cell cycle distribution in C6 cells

图4 LPS处理的C6细胞GSTs活性变化Fig.4 GSTs activity in C6 cells after treated with LPS

4 讨论

近年来，新的细胞毒性药物的发展使许多肿瘤治疗效果有了明显改观。尽管如此，肿瘤细胞对多种化疗药物产生多药耐药性，仍是造成化疗失败的主要原因。GSTs与肿瘤的多药耐药关系最为密切［7］。GSTs是一组多功能的药物代谢酶，能催化亲电子物质与GSH(谷胱甘肽)结合，并可与亲脂性细胞毒药物结合增强其水溶性，能促进药物排泄而降低抗癌药的作用。抗癌药物经GSTs代谢后对癌细胞的杀伤作用减弱，也就是说癌细胞对化疗药物的耐受力增加［8］。当长期使用抗癌化疗药物时，癌细胞中的GSTs水平就会提高，这种诱导作用将会导致癌细胞产生对化疗药物的耐药性，这也是癌细胞适应环境的一种表现［9］。本研究中，C6细胞在加入LPS后GSTs的活性随着药物浓度的增加及时间的延长而降低。其作用机制可能与LPS能够抑制自由基的产生并加快自由基的清除有关，从而减少GSHS的生成量，但具体机制仍不清楚，将有待于进一步的研究。

细胞周期主要由G1、S、G2和M 期组成。G1/S相和G2/M相转换处各有一个节点，通过对这两个节点的控制可调控细胞周期的进程，使不同的细胞周期事件在时间和空间上相互协调［10］。本研究结果表明，LPS主要作用于G1/S节点，使细胞停滞于G1期，阻滞G1期细胞向S期移行，从而使进入S期的细胞数量减少，S期即DNA合成期。LPS使肿瘤细胞DNA合成障碍，从而抑制C6细胞的生长代谢增殖等过程，最终诱导细胞的凋亡。综上所述，LPS能有效抑制大鼠胶质瘤的生长，使细胞周期阻抑在G1/S期。可作为恶性脑胶质瘤治疗的辅助治疗，减少化疗药物的用量，降低肿瘤转移和复发率，提高治愈率，从而提高肿瘤患者的生存质量。

［1］ Sun D，Lin H，Shi Y.Effect of Laminaria polysaccharide sulfate on proliferation and apoptosis in Hela cell［J］.J Pract Med，2005，21:1241-1243.

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［4］ Zhuang C，Itoh H，Mizuno T，et al.Antitumor active fucoidan from the brown seaweed，umitoranoo(Sargassum thunbergii)［J］.Biosci Biotechnol Biochem，1995，59:563-567.

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［6］ 李 晓，李晓波，徐中平，等.海带硫酸多糖的提取纯化工艺研究［J］.科技信息，2007(8):17-31.

［7］ 于冬青，易永芬.MRP、GST-π、TopoⅡα和 LRP在胃癌组织中的表达及意义［J］.癌症，2003，22(5):496-499.

［8］ David L E，Theo K B.Concise review of the Glutatuion S-transferases and their significance to toxicology［J］.Toxicol Sci，1999，49，156-164.

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［10］ Israels E D.The cell cycle［J］.Stem Cells，2001，19(1):88.