培美曲塞对SKP2蛋白表达的影响及意义

万 琴,王顺金

(南昌大学附属第二医院肿瘤科,江西南昌 330006)

培美曲塞对SKP2蛋白表达的影响及意义

万 琴,王顺金△

(南昌大学附属第二医院肿瘤科,江西南昌 330006)

目的探讨S期激酶相关蛋白2(SKP2)在培美曲塞(PMX)处理后肺腺癌细胞A549中表达的改变及意义｡方法根据PMX的浓度设1个对照组和4个实验组,分别为:0μmol/L组(A 组)､0.01μmol/L组(B组)､0.1μmol/L组(C组)､1μmol/L组(D组)､10μmol/L组(E组),采用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测A549细胞的增殖;利用流式细胞技术分析A549细胞周期的分布;通过Western blot法检测A549细胞SKP2蛋白表达｡结果PMX明显抑制A549细胞增殖,以10μmol/L､72h作用抑制率最高(P0.01);与A组相比C､D､E组S期细胞显著增多(P0.05);各组SKP2蛋白相对表达水平差异有统计学意义(P0.01);与对照组相比,实验组SKP2蛋白相对表达水平显著增加(P0.01)｡结论PMX能明显抑制A549细胞增殖且将其阻滞于S期,PMX处理后的A549细胞中SKP2蛋白表达上调,这可能影响PMX对肺腺癌的化疗疗效｡

肺肿瘤;细胞周期;S期激酶相关蛋白质类;培美曲塞

S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,SKP2)是SCF泛素连接酶复合体(Skp1-Cullin-1-F-box)的特异性底物识别亚单位,大量研究已证实SKP2基因是一种潜在的癌基因,主要存在于恶变细胞的S期,许多肿瘤细胞高表达或普遍表达SKP2蛋白｡SKP2的表达与非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)的发生､发展密切相关[1],并且是NSCLC的一个独立的预后指标[2-3]｡SKP2表达下调很可能有利于阻止肿瘤增长,被认为是NSCLC分子水平的一个新治疗靶点｡培美曲塞(pemetrexed,PMX)是一种新的多靶点叶酸抑制剂,通过抑制叶酸依赖性酶,干扰胸腺嘧啶和嘌呤的合成,达到抗肿瘤的目的｡PMX因有效､低毒等优点在NSCLC一线和二线治疗中的地位已经确立,并在维持治疗中显著延长患者总生存期,有关PMX的研究已经成为肿瘤学界的一个热点｡Wu等[4]研究发现PMX处理后A549细胞中P27表达上调,且在0～10μmol/L范围内,具有浓度依赖性｡SKP2能介导P27多聚泛素化蛋白水解,有关PMX对SKP2蛋白表达的影响国内外尚未见报道｡为此,本组检测了PMX对A549细胞周期及SKP2蛋白表达的影响,以探讨SKP2在PMX处理后的A549细胞中表达的改变及意义｡

1 材料与方法

1.1 材料 (1)细胞株:人肺腺癌细胞系A549细胞由南昌大学第二附属医院分子医学中心保存｡(2)主要试剂:PMX(江苏豪森,批号061101,含量102.2%)､DMEM 培养基､胰蛋白酶(北京Solarbio公司)､胎牛血清(美国Hyclone公司)､二甲基亚砜(美国Ameresco公司)､蛋白提取试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)､四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT;上海普飞生物技术有限公司)､酶标仪(芬兰Lab systems公司)､流式细胞仪(BD公司)､SKP2抗体(Santa Cruz公司)､山羊抗兔IgG抗体(中杉金桥公司)､免疫印迹配胶､电泳､电转装置(Bio-Rad公司)｡

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A549细胞用DMEM培养基(含10%胎牛血清､100U/mL青霉素和100U/mL链霉素),在5%CO2､37℃的条件下常规培养传代｡

1.2.2 MTT检测PMX对A549细胞的抑制率 取对数生长期细胞,制成细胞悬液,按每孔5×103/200μL,接种于3块96孔培养板中,24h后加入PMX,浓度分别为:0､0.01､0.1､1､10μmol/L｡3块板分别作用24､48､72h后加20μL浓度为5g/L的 MTT,37℃､5%CO2条件下孵育4h,吸出培养液,加二甲基亚砜150μL/孔,避光条件下置于水平摇床上摇10min,

1.3 统计学处理 用SPSS17.0软件进行数据分析,计量资料用±s表示,行单因素方差分析｡检验水准α=0.05｡使MTT晶体溶解,经酶标仪490nm波长检测光密度值(optical density,OD)｡按以下公式计算各组抑制率(inhibition rate,IR):抑制率IR(%)=(对照组OD均值-实验组OD均值)/对照组OD均值×100%｡实验重复3次｡

1.2.3 流式细胞周期技术 将细胞接种于6孔板,贴壁后加不同浓度PMX,24h后收集细胞,制成单细胞悬液,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)洗2次,离心,弃上清液,加PBS重悬细胞,加-20℃预冷的75%乙醇并振荡,4℃固定1h,离心,弃冰乙醇,PBS冲洗,弃上清液,加入含碘化吡啶和无DNA酶污染的PBS染色液,4℃避光静置1h,使用流式细胞检测仪检测G1､S､G2各期细胞所占的百分率｡重复3次｡

1.2.4 Western blot法检测SKP2的表达 收集处于对数生长期的A549细胞,根据细胞计数结果加入含10%胎牛血清的完全培养基,调整细胞浓度为5×105个/mL,接种于培养瓶,贴壁后加入不同浓度PMX,放入5%CO2孵箱中孵育48h后收集细胞,PBS洗涤2次,提取总蛋白,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法测定蛋白浓度｡取等量蛋白进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,电湿转法将凝胶上蛋白转至聚偏氟乙烯膜上｡5%脱脂奶粉室温封闭2h｡一抗孵育4℃过夜｡二抗室温孵育2h,暗室曝光｡重复3次｡

2 结 果

2.1 MTT比色法检测PMX对A549细胞增殖的抑制情况见表1｡由表1可见,PMX对A549细胞具有抑制作用,同一时间不同浓度PMX组之间的细胞增殖抑制率以10μM浓度组最高,同一浓度组分别作用24h､48h､72h后,以72h抑制率最高｡

表1 不同浓度PMX对A549细胞增殖的抑制率(±s,%,n=3)

表1 不同浓度PMX对A549细胞增殖的抑制率(±s,%,n=3)

*:P 0.01,与同时间组比较;#:P 0.01,与同浓度组比较｡

PMX(μmol/L)24h 48h 72h 0.01 7.19±3.31 10.93±7.31 21.88±10.23 0.1 17.07±7.89 18.53±7.33 27.39±7.66 1 28.03±7.39* 29.62±10.47* 44.34±7.04*10 58.63±0.86* 68.24±4.29*# 78.61±3.66*#

2.2 PMX使A549细胞周期阻滞在S期 不同浓度(0.01､0.1､1､10μM)的PMX处理A549细胞48h后,细胞周期被阻滞于S期｡见表2､封4图1｡

表2 流式细胞仪检测细胞周期分布的结果(±s,%,n=3)

表2 流式细胞仪检测细胞周期分布的结果(±s,%,n=3)

*:P0.05,#:P 0.01,与同周期0μmol/L组比较｡

细胞周期 0μmol/L 0.01μmol/L 0.1μmol/L 1μmol/L 10μmol/L 75 54.31±2.54 S 17.39±4.21 21.57±3.53 26.95±4.71* 34.76±3.85# 42.47±2.96#G2 5.39±3.69 10.09±7.88 9.33±2.44 5.88±3.91 3.G1 77.22±3.64 68.34±10.71 63.72±6.86 59.36±4.22±1.85

2.3 PMX处理A549细胞后SKP2蛋白表达升高 以目标蛋白灰度值与β-actin蛋白灰度值之比表示蛋白相对表达水平,各组的蛋白相对表达水平分别为:A组0.38±0.03､B组0.79±0.02､C组0.84±0.02､D组0.80±0.05､E组0.96±0.03,差异有统计学意义(P0.01);与 A组相比,B､C､D､E组蛋白相对表达水平显著增加(P0.01)｡PMX处理后SKP2蛋白表达升高,且在一定的浓度范围内,表达量随着PMX浓度的增加蛋白表达量也增加｡见封4图2｡

3 讨 论

SKP2位于人类第5号染色体短臂上(5p13),主要存在于恶变细胞的S期,能特异性地识别磷酸化的细胞周期蛋白(cyclin)如:p27kip1､p130､p21wafl､p53､E2F､cyclin D1､cyclin E､cyclin A､cyclin B等依赖性激酶抑制剂,并参与这些蛋白的降解,导致细胞周期抑制物减少,细胞过度增殖,促进恶性肿瘤的发生､发展｡SKP2在许多肿瘤细胞中高表达或普遍表达,在高表达的肿瘤中,通过下调SKP2的表达可能抑制肿瘤的增长[5]｡Kudo等[6]将SKP2siRNA质粒转染于口腔鳞癌细胞后发现,SKP2沉默会导致P27kip1表达的增加,抑制口腔鳞癌细胞的增殖｡同样,Lee与 McCormick[7]通过干扰恶性脑胶质瘤细胞株T98G中SKP2的表达可以促进T98G凋亡,推断SKP2可作为癌基因治疗的一个靶点｡SKP2在NSCLC中也普遍表达,并在NSCLC的发生､发展中起重要作用,下调SKP2会导致 NSCLC细胞的凋亡[8]｡Jiang等[9]将SKP2-siR-NAs转染于3株肺癌细胞株后SKP2蛋白表达降低,P27蛋白表达升高,其中肺腺癌细胞A549细胞转染SKP2-siRNAs后,细胞增殖率降低12%,凋亡率升高36%｡因而,本组认为剔除SKP2基因的过度拷贝或抑制SKP2蛋白的表达,将成为治疗恶性肿瘤的一条新路径｡

PMX是一种新的多靶点叶酸抑制剂,通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合酶､二氢叶酸还原酶和甘氨酰胺核苷酸转甲基酶,影响DNA和RNA的合成,使细胞停滞于S期,从而促进肿瘤细胞的凋亡达到抗肿瘤的作用｡在NSCLC中,PMX主要用于治疗局部晚期或转移性NSCLC(不包括大多数的鳞状细胞癌),它对肺腺癌及大细胞癌的疗效远远优于鳞状细胞癌｡因此,本研究选用PMX敏感的肺腺癌细胞A549细胞为实验对象,通过MTT证实PMX对A549细胞具有明显抑制作用,且在一定浓度范围内,抑制作用随着浓度增加而增强,以10μmol/L的抑制作用最明显｡通过流式细胞周期技术分析发现,PMX主要使A549细胞阻滞于S期,这与 Wouters等[10]的文献报道相符｡

本研究旨在探讨NSCLC治疗中常用新药PMX对SKP2蛋白表达的影响及意义,以了解PMX是否能通过对SKP2的下调进一步促进肿瘤细胞的抑制｡本实验通过Wes tern blot法表明PMX处理后的A549细胞中SKP2表达并未下调,相反,实验组SKP2蛋白表达量明显高于对照组,且随着药物浓度的增加,其表达量也增加｡SKP2表达上调可能促进肿瘤细胞的增殖,然而MTT法显示PMX对A549细胞具有明显的抑制作用,本组推断虽然PMX处理后细胞SKP2表达升高,但是SKP2的升高引起的细胞增殖不足以抵抗PMX对肺腺癌细胞的抑制作用,所以总体表现为抑制｡SKP2表达的增加是PMX直接作用的结果还是对细胞周期调节后的表现,其具体机制还不清楚,需要作进一步研究｡再者,SKP2是癌基因,SKP2蛋白表达上调是否与PMX治疗的疗效及预后有关目前尚不知晓,这必须引起重视并进行更深入的研究｡

SKP2也是一个重要的预后评价指标,SKP2在卵巢癌､软组织肉瘤､口腔鳞癌､胃癌和直肠癌中的表达与预后相关都见诸报道｡人们发现SKP2高表达患者预后差,SKP2的表达就像N分期一样是总生存率的一个独立预测指标｡Osoegawa等[11]通过多因素分析显示SKP2是NSCLC的一个独立预后因子,SKP2高表达的NSCLC患者预后不良｡SKP2是否是PMX治疗肺腺癌的一个预后指标也有待进一步的研究｡

总之,本实验再次肯定了PMX对肺腺癌细胞的抑制作用以及S期阻滞;本研究发现PMX处理后肺腺癌细胞A549细胞中SKP2蛋白表达升高,其具体机制目前尚不清楚,但SKP2是癌基因,其表达上调可能影响PMX的化疗疗效及预后｡同时,进一步探讨PMX与特异性下调SKP2表达的药物联用后疗效是否会增加将为今后临床更好地使用PMX以及提高肺腺癌患者的化疗疗效提供重要的理论基础｡

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Impact of Pemetrexed on expression of SKP2 in adenocarcinoma of lung cell lines A549 cellandits significance

,
(,,,, 330006,)

ObjectiveTo investigate the expression variation and significance of s-phase kinase-associated protein 2(SKP2)in lung adenocarcinoma A549cells after the treatment of Pemetrexed(PMX).MethodsOn the basis of the concentration of PMX,we set one control group and four experimental groups:0μM(group A),0.01μM(group B),0.1μM(group C),1μM(group D),10μM(group E).The growth of A549was tested by MTT assay.The effect of PMX on the cell cycle phase distribution of A549was analyzed by flow cytometry.The expression of SKP2protein of A549cells was detected by Western blot.ResultsMTT assay showed that PMX could significantly inhibit the growth of A549cells,and the highest inhibitory rate was(78.61±3.66)%at the concentration of 10μM when A549cells were cultured for 72h(P0.01).Meanwhile,S-phase cells in the group C,D and E was more than those in the group A(P0.05,P0.01,P0.01).The difference of SKP protein expression among various groups was significant(P0.01),and compared with the control group,SKP2protein expression was significantly increased in the experimental groups(P0.01).ConclusionPMX could inhibit the growth of A549cells and arrest them in S-phase.The expression of SKP2 protein in PMX-treated A549cells is upregulated,which might influence the chemotherapy effect of PMX.

lung neoplasms;cell cycle;S-phase kinase-associated proteins;pemertrexed

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.020

A

1671-8348(2012)16-1614-03

△通讯作者,Tel:13970018719;E-mail:wangshunjin1950@163.com｡

2011-11-08

2011-12-22)

•临床研究•