禽流感病毒BEI灭活疫苗制备与免疫效果

施维松，陈瑞爱，张晓楠，詹烜子，唐兆新

（1.广东省兽用生物制品生物工程技术研究与应用企业重点实验室，广东 肇庆 526238；2.肇庆大华农生物药品有限公司，广东 肇庆 526238）

禽流感（AI）是由A型流感病毒引起的一种以侵害呼吸系统为主的疾病，是危害禽类健康的重要传染病之一。该病给养禽业带来了巨大的经济损失，同时也对人类健康带来严重威胁。AI的防控研究具有重要的经济学和公共卫生意义。

疫苗免疫是我国AI防控禽流感传播的重要途径。我国从20世纪90年代开始禽流感病毒（AIV）灭活疫苗研究，其中H5N1亚型重组病毒株的AIV灭活疫苗已经广泛应用，具有良好的免疫效果，在H5N1亚型禽流感的防控中起到了重要的作用。国内的禽流感灭活疫苗的生产工艺中，灭活过程都是使用甲醛溶液作为灭活剂，其灭活能达到很好的效果，但是甲醛灭活不仅灭活了病毒也破坏了病原体的免疫原性，并且甲醛灭活时间比较长，易受温度、pH值、浓度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响，残留的游离甲醛，若随疫苗注入机体后，会产生应激性反应。所以需要寻找更加安全可靠的灭活剂进行病毒的灭活。BEI是一种烷化剂，对病毒具有很强的灭活作用，其作用原理是破坏微生物核酸，而不影响其蛋白质成分，并保持病毒抗原性［1-2］。本试验通过使用不同终浓度的BEI和不同的灭活时间、温度对AIV进行灭活，确定BEI的灭活条件，并制备疫苗进行免疫试验，结果表明，该灭活苗安全、可靠，其免疫原性明显优于甲醛灭活疫苗。

1 材料与方法

1.1 抗原 禽流感H5N1亚型（Re-5株）抗原由肇庆大华农生物药品有限公司生产；禽流感H5N1亚型（Re-5株）诊断抗原，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.2 试验动物与鸡胚 3～4周龄SPF鸡及10日龄鸡胚，均购自新兴大华农禽蛋有限公司SPF实验动物中心。

1.3 主要试剂 二乙烯亚胺（BEI），购自TCI公司；硫代硫酸钠，购自 Alfa公司；PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit、RNAiso plus总 RNA提取试剂、dNTP和Ex Taq，均购自TaKaRa公司；PCR引物由Invitrogen公司合成。

1.4 BEI的配制 用0.2mol／L NaOH溶液配制浓度为0.1mol／L BEI溶液［3］。

1.5 抗原灭活 在负压生产区，根据病毒液的量分别加入终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%的BEI，至于37℃恒温摇床中（120r／min），分别灭活1，2，4，8，12，18，24h后，加 BEI用量10%硫代硫酸钠终止反应。

1.6 灭活效果检测 灭后样品按照生产规程灭活检验要求接SPF鸡胚，孵育后72h检测血凝价，并盲传一代，检测血凝价。

1.7 血凝（HA）试验 取灭活前后的病毒液，按照中国兽药典红细胞凝集试验（CVP3／2010／FL／010）分别测定HA。

1.8 灭后病毒完整性 常规方法扩增病毒，提取RNA，反转录获得cDNA。根据GenBank AIV核苷酸序列设计并合成HA引物，上游引物：5′-aaaatggagagaatagtgctt-3′，下 游 引 物：5′-ctacaatctgaactcaataaat-3′，HA基因片段总长度为1720bp。

1.9 BEI灭活疫苗制备 按照规程规定，油水比例2∶1进行乳化，分装备用。

1.10 BEI灭活疫苗安全性检验 60羽SPF鸡随机分为6组，每组10羽，其中1、2、3、4、5组用5批BEI灭活疫苗安全性评价，每羽鸡胸部肌肉注射2 mL。6组空白对照组，不接种。

1.11 BEI灭活疫苗效力试验 110羽SPF鸡随机分为11组，每组10羽，1～5组用于5批BEI（0.5%）灭活疫苗免疫接种，6～10组用于对应的甲醛（0.2%）灭活对照组疫苗的免疫接种，11组作为空白对照组，比较BEI灭活疫苗的免疫效果。每羽鸡胸部肌肉注射0.3mL，免疫后14d、21d逐羽采血分离血清，进行HI抗体检测。

2 结果

2.1 BEI灭活抗原结果 不同浓度BEI 37℃灭活抗原不同时间点取样，进行灭活效果检测，结果BEI终浓度≥0.5%，病毒能够完全灭活，重复3次结果保持一致（见表1）。

表1 不同浓度BEI灭活禽流感病毒结果

2.2 血凝试验结果 病毒液灭活前平均HA价为8.4log2，灭活后平均HA价为8.4log2，表明BEI在灭活前后对AIV的效价无影响（见表2）。

表2 灭活前后HA价结果

2.3 病毒完整性检测结果 通过设计的HA引物对病毒灭活前后提取的总RNA进行检测，终浓度0.5%的BEI在37℃灭活病毒24h后，5批样品均扩增不到目的条带（见图1）；该结果与灭活效果结果一致，表明在这些条件下病毒已经被灭活。

2.4 BEI灭活疫苗安全性试验结果 观察至免疫后14d，各试验组鸡只均健活，剖检观察疫苗吸收良好，未出现异常情况。

图1 病毒灭活前后HA基因扩增结果

2.5 BEI灭活疫苗效力试验结果 BEI灭活疫苗和对照疫苗免疫14d、21d后分别采血进行抗体水平检测，结果BEI灭活疫苗免疫14d、21d的平均效价分别为7.27log2、8.35log2，同批抗原对照甲醛灭活疫苗免疫14d、21d的平均效价为6.33log2、7.66log2（见表3）。由试验结果看出，禽流感病毒BEI灭活疫苗诱导鸡只产生抗体的能力高于甲醛灭活疫苗。

3 讨论

禽流感是对我国养禽业危害较大的疫病之一。预防该病主要采用禽流感灭活疫苗，传统的AIV灭活方法是使用甲醛灭活，易使病毒表面融合蛋白抗原受到破坏，同时可能存在灭活病毒不彻底，免疫动物易发生感染现象［4］。BEI灭活疫苗的最大特点就是BEI破坏病毒的核酸，使病毒完全丧失感染力，而不损坏其蛋白质衣壳，保留其保护性抗原，病毒的免疫原性几乎不受破坏［5-6］。从实际应用考虑，BEI灭活剂为瓶装固体粉末，性质稳定，便于运输和保存，同时配制简单，灭活效果好，使用成本较低，适合于大生产应用。本研究使用终浓度0.5%BEI能够完全灭活禽流感病毒，由BEI灭活的禽流感病毒制成灭活疫苗对免疫动物安全，并且能保持良好的免疫原性，21d的免疫效价为8.35log2，同比的甲醛灭活疫苗免疫效价只有7.66log2，说明BEI灭活疫苗诱导鸡只产生抗体的能力要优于甲醛灭活疫苗。虽然研究已经获得了实验室BEI灭活禽流感病毒的浓度和灭活时间，但还要在实际生产中对BEI灭活剂灭活禽流感病毒的浓度和时间进行深入的探讨。

表3 BEI灭活疫苗免疫效果

［1］Yohannes Berhane ，Jody D Berry ，Charlene Ranadheera ，et al.Production and characterization of monoclonal antibodies against binary ethylenimine inactive Nipah virus［J］.Journal of Virological Methods，2006 ，132：59-68.

［2］徐守振 ，尹燕博 ，王新.动物疫苗中常用抗原灭活剂的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2010，37（9）：162-167.

［3］Habib Mudasser，Hussain Iftikhar，Fang ，et al.Inactivation of infectious bursal disease virus by binary ethylenimine and formaldehyde［J］.Journal of Zhejiang University SCIENCE B，2006 ，7（4）：320-323.

［4］魏晓露，刘婧，高菁霞，等.二乙烯亚胺灭活流感病毒的效果观察［J］.中国生物制品学杂志，2008，21（5）：395-397.

［5］Habib Mudasser，Hussain Iftikhar，Irshad Hamid，et al.Immunogenicity of formaldehyde and binary ethylenimine inactive infectious bursal disease virus in broiler chicks［J］.Journal of Zhejiang University SCIENCE B ，2006，7（8）：660-664.

［6］Aarthi D，Ananda Rao K，Robinson R，et al.Validation of binary ethyleneimine（BEI）used as an inactivant for foot and mouth disease tissue culture vaccine［J］.Biologicals，2004，32：153-156.