8种中药多糖及其硫酸化衍生物对新城疫病毒的影响

王春花，金秧敏，张燕华，李春艳，张秀英

（1.东北农业大学，黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江农业经济职业学院，黑龙江 牡丹江 157041；3.浙江大学，浙江 杭州 310058）

新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一种急性、高度接触性的禽类烈性传染病，给我国养禽业带来了严重的危害，至今对于该病的治疗仍无有效的药物。研究表明，中药多糖可影响NDV感染作用，但目前并无多糖药物应用于临床治疗新城疫病毒性疾病，这除了由于体内外试验差异因素导致外，还可能是由于中药中所含的有效活性多糖含量低或中药多糖本身药效低，使多糖临床治疗效果不足，报道显示，硫酸化修饰的方法可改变多糖的抗病毒活性。本试验选取含多糖成分并具有抗病毒活性的中药为研究对象，提取多糖，通过氯磺酸-吡啶法硫酸化修饰多糖，以鸡胚成纤维细胞（CEF）为平台，通过体外细胞筛选出高活性的抗NDV多糖，为多糖药物的研究及防治新城疫病毒性疾病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与病毒 中药黄芪，大黄，牛膝，板蓝根，当归，甘草，黄精，紫草，均购自哈尔滨世一堂药店；所用试剂均为国产分析纯；F48E9新城疫病毒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽病实验室提供；9周龄SPF鸡胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.2 中药多糖和硫酸化多糖的制备［1］采用传统的水提醇沉法提取中药多糖，硫酸化吡啶法硫酸化修饰多糖，多糖和硫酸化多糖溶液进行190～500 nm区间紫外可见光连续吸收扫描，比较修饰前后吸收峰变化。

1.3 多糖及硫酸化多糖抗NDV活性测定 鸡胚成纤维细胞培养方法参照文献［2］，选择均匀、生长良好的细胞接种倍比稀释NDV病毒液，培养，观察记录，根据Reed-Muench公式计算TCID50值。

设定两种加药方式，先加100μL多糖作用12 h，再加100μL病毒吸附2h组与先病毒吸附2h后作用多糖组，作用多糖浓度见表1～8，作用100TCID50病毒浓度为10-4.56，测定多种多糖对新城疫病毒的影响，每个药物每种浓度4个孔，所有试验均做3次重复。

CPE、OD值及选择指数（selection index，SI）比较法综合评价抗病毒效果，SI＝最大无毒浓度／最小有效浓度。

1.4 数据处理 试验数据用SPSS13.0统计分析软件进行方差分析和多重比较，数据用表示。

2 结果与分析

2.1 硫酸化多糖效果 多糖和硫酸化多糖紫外吸收峰比较看出，8种多糖经氯磺酸-吡啶法硫酸化修饰的多糖出现新的吸收峰位于260～300nm，表示硫酸酯化多糖已合成。

2.2 多糖及其硫酸化多糖抗NDV作用数据 8种多糖及其硫酸化多糖抗NDV作用结果见表1～8，显示8种多糖均具有一定抗病毒活性，以黄芪多糖效果最明显，治疗指数达8，当归多糖、板蓝根多糖次之，紫草及黄精多糖效果不显著，治疗指数低于2。硫酸化修饰后当归和大黄多糖的抗病毒活性提高，治疗指数高达16，表现强抗NDV作用。抗病毒效果比较结果见图1，显示8种多糖及其硫酸化修饰物作用的NDV感染后细胞，细胞OD值都高于病毒对照组，说明中药多糖对NDV有一定的干扰作用。图中1组先加多糖组均高于2组后加多糖组数据，说明多糖对新城疫的干扰作用主要来自对细胞的保护，只能抑制病毒的扩散而不能直接杀伤NDV。

3 讨论

目前体外细胞试验测定方法主要包括细胞病变抑制法、pH值转变法、染色法与蚀斑降低法［3-4］，根据测定方法的优缺点，本试验采用CPE抑制法与MTT染色相结合的方法，在CPE观察的基础上初步判定所选成分的抗病毒活性，然后采用MTT染色法，对所选成分的抗病毒活性的大小进行定量测定。既克服了CPE法主观性强，不能定量分析的缺陷，又通过观察细胞的CPE，决定进行MTT测定的最适时间，保证了结果的准确性。

试验显示，多糖成分对新城疫病毒感染的细胞都有一定的影响作用，与胡元亮等人［5］试验得出结论相符。其中以黄芪和板蓝根效果最好，治疗指数可达8，其中关于大黄多糖，紫草多糖，黄精多糖抗NDV作用未见报道。

表1 牛膝多糖和硫酸化牛膝多糖各组细胞CPE和OD值的变化

表3 板蓝根多糖和硫酸化板蓝根多糖各组细胞CPE与OD值的变化

表4 当归多糖和硫酸化当归多糖各组细胞CPE和OD值的变化

表5 黄精多糖和硫酸化黄芪多糖各组细胞CPE和OD值的变化

表6 大黄多糖和硫酸化大黄多糖各组细胞CPE和OD值的变化

表7 紫草多糖和硫酸化紫草多糖各组细胞CPE和OD值的变化

表8 甘草多糖和硫酸化甘草多糖各组细胞CPE和OD值的变化

图1 多糖抗新城疫病毒作用柱状图

试验结果显示，抗NDV作用比较低的牛膝多糖、大黄多糖和当归多糖经硫酸化修饰后其对NDV抑制作用显著增强，此趋势与郑民实等［6］报道的多糖修饰上硫酸根后活性增强结论一致，说明通过硫酸化修饰可使多糖抗NDV活性增强，但试验中也发现板蓝根多糖和甘草多糖经修饰后活性反而降低，分析原因可能为部分有效多糖在剧烈的化学反应中被破坏，导致抗新城疫病毒活性降低。

试验结果表明，随着加药方式的不同，多糖及硫酸化多糖的抗病毒活性有差异性。先加药物后接种病毒的目的是观察多糖能否进入细胞或吸附于细胞表面，以阻止病毒的吸附与侵入，先接种病毒后加多糖的目的是观察药物能否对已进入细胞内的病毒起作用，抑制其生物合成及成熟释放［7］。多糖抗NDV作用比较显示，1组先加多糖组均高于2组后加多糖组数据，说明多糖对NDV的干扰作用主要来自对细胞的保护，只能抑制病毒吸附与侵入，而不能对已进入细胞内的病毒起作用，抑制其生物合成，成熟释放或直接杀灭NDV。

［1］张惟杰.糖复合物生化研究技术［M］.杭州：浙江大学出版社，1999.

［2］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.3版.北京：科学出版社，1997.

［3］邬洪波，李洪梅，卢长安，等.双黄连分散片抗病毒作用实验研究［J］.中国实验方剂学杂志.2004，10（3）：48-50.

［4］Yao lan Li，Linda S M Ooil，Hua Wang，et al.Antiviral Activities of Medicinal Herbs Traditionally Used in Southern Mainland China［J］.Phytother Res，2004，18：718-722.

［5］胡元亮，孔祥峰，李祥瑞.10种中药成分对CEF的增殖和抵抗NDV感染的影响［J］.畜牧兽医学报，2004，35（3）：301-305.

［6］郑民实，江惟，苏李文.牛膝多糖硫酸酯抗I型单纯疱疹病毒的实验研究［J］.中国医院药学杂志，1996，16（11）：483-486.

［7］李凡，易世红，赵春艳，等.双黄连粉针剂抗病毒作用［J］.中草药，2002，33（1）：52-54.