四君子汤加减颗粒对腹腔巨噬细胞吞噬功能及ND和IBD疫苗免疫效果的影响

张桂枝，罗永煌，侯春彬，靳双星

（1.西南大学药学院，重庆 北碚 400715；2.郑州牧业工程高等专科学校畜牧系，河南 郑州 450011；3.重庆市兽药工程技术研究中心，重庆 北碚 400716）

近年来，由于病毒的变异、免疫抑制疾病的存在、不合理的疫苗接种以及应激等因素，导致畜禽传染病疫苗免疫效果不佳，给养殖业造成巨大的经济损失。因此，如何激活机体的免疫系统、提高机体的免疫力、增强机体的抗病能力，一直是国内外学者关注的焦点。中药以其毒性低、副作用小、多靶点、病原微生物对其不易产生耐药性等优点引起人们越来越多的关注，尤其在免疫抑制性疾病和增强机体免疫机能方面中药发挥着巨大的作用［1-5］。四君子汤由人参、白术、茯苓和甘草四味中药组成，主治脾胃气虚。本课题组依据畜牧生产和兽医临床特点，将四君子汤中的人参改为具有明显免疫增强作用的黄芪［6-7］，同时加入具有清热解毒及免疫增强作用的板蓝根、连翘［8-9］以及健脾消食的山楂和理气消食的枳实，按处方中各药所含有效成分的理化性质，分别采取醇提、水提和蒸馏的方法，提取中药有效组分，制备成中药复方颗粒剂，考察其对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能以及肉用仔鸡免疫鸡新城疫（ND）疫苗、传染性囊病（IBD）疫苗后血清ND及IBD抗体效价的影响，旨在为兽医临床及生产应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 四君子汤加减颗粒的组成及制备 四君子汤加减颗粒由黄芪、白术、茯苓、甘草、板蓝根、连翘、山楂和枳实组成。先用乙醇提取连翘的醇溶性有效组分。白术、枳实采用蒸馏法提取挥发油。连翘、白术和枳实的药渣，与黄芪、茯苓、甘草、山楂、板蓝根混合，水煎2次，合并水煎液浓缩至比重1.10（温度60℃），加入乙醇沉淀水溶性组分中的杂质，滤液与连翘的醇提液混合，经浓缩制备流浸膏，再与一定量的蔗糖粉混合制软材，制湿颗粒，干燥，整粒，最后将白术、枳实的挥发油喷洒在整粒后的颗粒表面，适度混匀、阴干即得（1g颗粒相当于原生药1.4g）。

1.1.2 主要试剂 ND Clone-30疫苗、ND-LaSota油乳剂灭活苗、ND标准浓缩抗原、ND标准阳性血清；IBD冻干苗、IBD标准琼扩抗原、IBD标准阳性血清等。

1.1.3 试验动物 昆明系小鼠，体重18～20g。1日龄健康AA肉仔鸡，隔离饲养至所需日龄，选取360只发育均匀的健康鸡供试验用。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定［10］将40只小鼠随机分为4组，每组10只。第1组为对照组，正常饮水；第2、3、4组为试验组，饮水中分别加入0.3%、0.6%、0.9%的四君子汤加减颗粒，连用5d。试验前4d，每只小鼠每天腹腔注射1次6%可溶性淀粉肉汤1mL。第5天，给小鼠腹腔注射1%鸡红细胞悬液1mL；30min后，再给小鼠腹腔注射1mL生理盐水并轻柔腹部；20min后脱颈法处死小鼠，用注射器吸取腹腔液少许制成薄推片。瑞士染色镜检，计算吞噬百分率和吞噬指数。吞噬百分率＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数／巨噬细胞总数×100；吞噬指数＝巨噬细胞吞噬的鸡红细胞总数／吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数。

1.2.2 鸡血清中ND和IBD抗体效价的测定

1.2.2.1 试验动物分组 选取7日龄、10日龄和14日龄的非免疫健康鸡各120只。各日龄鸡只分别分为4组，每组30只，第1组为对照组；第2、3、4组为试验组，免疫的同时，饮水中分别加入0.3%、0.6%、0.9%四君子汤加减颗粒，连用3周。每组隔离饲养，各组鸡的饲料成分及饲养管理方式完全相同。

1.2.2.2 试验动物处理 7日龄4组鸡按2羽份／只点眼、滴鼻 ND Clone-30疫苗，在免疫前、14、21日龄及28日龄，各组分别随机抽取7只鸡，采血，分离血清测定ND抗体效价。10日龄4组鸡颈部皮下注射ND油乳剂灭活苗0.3mL／只，在免疫前、17、24日龄及31日龄，各组分别随机抽取7只鸡，采血，分离血清测定ND抗体效价。14日龄4组鸡按2羽份／只滴口IBD疫苗，在免疫前、21、28日龄及35日龄，各组分别随机抽取7只鸡，采血，分离血清测定IBD抗体效价。

1.2.2.3 血清中ND抗体效价的测定 采用微量红细胞凝集抑制（HI）试验测定，抗体效价的高低用血清阳性最高稀释倍数（nlog2）表示。

1.2.2.4 血清中IBD抗体效价的测定 采用琼脂扩散沉淀反应 （AGP）测定，抗体效价的高低用血清阳性最高稀释倍数（nlog2）表示。

1.2.3 数据分析 用SPSS软件统计进行分析。

2 结果与分析

2.1 四君子汤加减颗粒对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 由表1可见，小鼠饮用四君子汤加减颗粒后，试验组腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数均显著高于对照组（P＜0.05）；第3、4两组均显著高于第2组（P＜0.05）。第3、4两组之间无显著差异（P＞0.05）。

表1 四君子汤加减颗粒对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

2.2 四君子汤加减颗粒对ND Clone-30疫苗免疫效果的影响 由表2可见，免疫前（即7日龄）各组的ND抗体效价无显著差异（P＞0.05）。免疫后的3个日龄阶段，第3、4两组的抗体效价均显著高于第2组和对照组（P＜0.05），第3、4两组之间无显著差异（P＞0.05）。

表2 四君子汤加减颗粒对ND Clone-30疫苗免疫效果的影响

2.3 四君子汤加减颗对ND油乳剂灭活疫苗免疫效果的影响 由表3可见，免疫前（即10日龄）各组的ND抗体效价无显著差异（P＞0.05），免疫后的3个日龄阶段，试验组的ND抗体效价均高于对照组，但在第17日龄，第2组抗体效价与对照组比较无显著差异（P＞0.05）。第3、4两组的ND抗体效价显著高于第2组和对照组（P＜0.05）。第3、4两组之间无显著差异（P＞0.05）。

表3 四君子汤加减颗粒对ND油乳剂灭活疫苗免疫效果的影响

2.4 四君子汤加减颗粒对IBD疫苗免疫结果的影响 由表4可见，免疫前（即14日龄）各组的IBD抗体效价无显著差异（P＞0.05）。在28日龄和35日龄试验组的IBD抗体效价均显著高于对照组（P＜0.05），第 3、4 两 组 显 著 高 于 第 2 组 （P＜0.05），第3、4两组之间无显著差异（P＞0.05）。

3 讨论

四君子汤加减颗以益气健脾和胃为主，兼以清热解毒、消导理气。其中黄芪、白术补中益气，茯苓健脾利水，板蓝根、连翘清热解毒兼有扶正作用，枳实行气，山楂健脾消食，甘草调和诸药。

表4 四君子汤加减颗粒对IBD疫苗免疫结果的影响

现代免疫学研究证明，动物体内的巨噬细胞在维持机体自身稳定中起重要作用，巨噬细胞既能特异性地吞噬多种病原微生物，也能有效地清除体内损伤、衰老、死亡的细胞，还能杀伤肿瘤细胞，并且有处理和传递抗原信息的作用。通过调节淋巴细胞的应答机能参与体内的免疫，因此，对巨噬细胞的检测是衡量机体免疫功能的重要指标。本试验中以淀粉肉汤培养液刺激小鼠腹腔，能提高巨噬细胞产率和纯度；以鸡红细胞作为抗原，具有体积大、特征显著，易于识别等优点，可较准确地鉴定巨噬细胞的吞噬作用。本试验结果表明，四君子汤加减颗粒能够提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性，增强机体免疫功能，发挥扶正祛邪的作用。

体液免疫是由抗原刺激B淋巴细胞，引起B淋巴细胞活化、增殖与分化，形成浆细胞并产生抗体，抗体效价的变化反映了机体的体液免疫状态。本试验结果表明，四君子汤加减颗粒分别与ND Clone-30疫苗、N D油乳剂灭活苗和IBD冻干苗合用，均可使鸡血清ND和IBD抗体效价高于或显著高于对照组，显示出四君子汤加减颗粒可明显增强这3种疫苗的免疫效果。

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