复方黄连注射剂的体外抑菌和耐药抑制作用研究

游思湘，何湘蓉，孟海波，贺建华

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学继续教育学院，湖南 长沙 410128；3.湖南农业大学动物科技学院，湖南 长沙 410128）

解决细菌的耐药性一直是全球关注的问题，研究耐药抑制剂成为关注的焦点［1-2］。基于中药具有无残留、作用靶位多、有效成分多、作用范围广，不易产生耐药性等优点，因此从中药中筛选耐药抑制剂成为一个新的研究方向［3］。本文以中医药理论为指导，以清热解毒的经典中药方剂-黄连解毒汤为基础，采用现代分离纯化技术和生产工艺对其活性成分进行分离、提取、纯化和精制，制备了天然耐药抑制剂-复方黄连注射剂，并探讨复方黄连注射剂对耐药金黄色葡萄球菌的体外抑菌和耐药抑制作用，以便为中药耐药抑制剂的开发提供研究思路和研究基础。

1 材料与方法

1.1 菌株 5株耐药金黄色葡萄球菌，均由中国农业大学提供，分离于内蒙古奶牛乳房炎，金黄色葡萄球菌质控菌株ATCC29213，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 药品 氧氟沙星、诺氟沙星、阿莫西林、头孢噻吩、环丙沙星等原料药由湖南农大动物药业有限公司提供，上述药物含量为98%～99%。药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司。含生药1g／mL复方黄连注射剂，由湖南农业大学药学系制备，该制剂各指标符合《中国药典》2005年版要求。

1.3 主要仪器设备 PYX-250Z-C恒温振荡培养箱；DNP-9162型电热恒温培养箱；YXQ-IS-SII全自动高压灭菌器；SW-CJ-I超净台。

1.4 耐药金黄色葡萄球菌的耐药性检测 采用药敏纸片法和倍比稀释法［4］。

1.5 复方黄连注射剂对耐药金黄色葡萄球菌的体外抑菌试验

1.5.1 最低抑菌浓度（MIC）的测定 采用倍比稀释法［4］。将复方黄连注射剂作二倍递减浓度稀释，1～9号试管内药物浓度为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156、0.0078、0.0039、0.00195g／mL。第10号试管加药液不加菌液，作为阴性对照，第11号试管加菌液不加药液，作为阳性对照。将各管置35℃振荡培养18h后取出，观察并判定药物的最低抑菌浓度（MIC）。

1.5.2 药敏试验 取直径为6mm的灭菌滤纸片，滴加复方黄连注射剂，自然干燥后，再滴加复方黄连注射剂，重复3次。然后取制备好的复方黄连注射剂药敏纸片按照药敏纸片法进行操作。

1.5.3 最低杀菌浓度（MBC）的测定 将MIC测定中的无细菌生长试管肉汤用移液器分别吸取0.1 mL培养物，移种于营养琼脂上，推开药液，置35℃培养过夜。

1.6 复方黄连注射剂对耐药金黄色葡萄球菌体外耐药抑制试验

1.6.1 平板挖孔法 采用文献［5］方法。

1.6.2 药敏纸片法 试验组耐药金黄色葡萄球菌在含有抑菌浓度的复方黄连注射剂MH培养液中35℃振荡培养过夜；对照组在MH培养液中35℃振荡培养过夜。然后取各组菌液0.1mL分别涂布于MH琼脂培养基上，贴环丙沙星或氧氟沙星药敏纸片，置35℃培养18h。记录结果。

2 结果

2.1 耐药金黄色葡萄球菌的耐药性检测 根据NCCLS标准［4］判读，试验所用耐药金黄色葡萄球菌Sa1～Sa5菌株对氧氟沙星、诺氟沙星、阿莫西林、头孢噻吩、环丙沙星等抗菌药物均具有耐药性，为多重耐药株。

2.2 复方黄连注射剂的体外抑菌试验

2.2.1 复方黄连注射剂对耐药性金黄色葡萄球菌的MIC测定结果 复方黄连注射剂对5株耐药性金黄色葡萄球菌的MIC测定结果见表1。

表1 复方黄连注射剂对耐药性金黄色葡萄球菌的MIC测定结果

2.2.2 最低杀菌浓度（MBC）的测定 以平皿培养基中计数少于5个菌落者作为该药物的最低杀菌浓度（MBC），复方黄连注射剂对Sa1，Sa2，Sa3、Sa4、Sa5耐药性金黄色葡萄球菌的MBC分别为0.0625、0.0625、0.0312、0.0312g／mL 和 0.0625 g／mL。

2.2.3 抑菌圈直径测定结果 复方黄连注射剂对5株耐药性金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径测定结果见表2。

2.4 复方黄连注射剂的体外耐药抑制试验

2.4.1 平板挖孔试验结果 以两孔周围细菌生长，但两孔间有细菌不生长的区域，视为耐药抑制有效；两孔周围及孔间细菌均生长成片状，视为耐药抑制无效作用的平板挖孔试验判断标准进行判断：Sa1、Sa3、Sa5两孔中间均未长菌，Sa2和Sa4两孔之间长有少量细菌，说明复方黄连注射剂对耐药性金黄色葡萄球菌具有一定的耐药抑制作用。

表2 复方黄连注射剂抑菌圈直径测定结果

2.4.2 药敏纸片法试验结果 耐药性金黄色葡萄球菌经过复方黄连注射剂处理后，对环丙沙星和氧氟沙星药敏纸片的敏感性变化结果见表3。

3 讨论

3.1 耐药性检测 判断细菌对抗菌药物的耐药性一般通过测量药敏纸片法与倍比稀释法的抑菌圈直径和MIC值获得。本试验按照NCCLS［4］试验要求判读结果，所用耐药性金黄色葡萄球菌S1～S5菌株对氧氟沙星、诺氟沙星、阿莫西林、头孢噻吩、环丙沙星等抗菌药物均具有抗药性，为多重耐药株。

表3 复方黄连注射剂处理和未处理组抑菌圈直径测定结果 （mm）

3.2 复方黄连注射剂对耐药性金黄色葡萄球菌的体外抑菌作用 复方黄连注射剂对耐药性金黄色葡萄球菌Sa1～Sa5的最低抑菌浓度均为0.0078g／mL，抑菌圈直径在14.50～16.00mm之间，；最低杀菌浓度在0.0312g／mL～0.0625g／mL之间，体外抑菌结果表明，复方黄连注射剂对耐药性金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用。据有关文献报道，很多中药提取物或中药复方制剂对细菌具有较强的抑制作用。如杨林富等［6］报道，黄荆提取物对金黄色葡萄球菌有明显抑菌效果，MIC为0.05g／mL。

3.3 复方黄连注射剂对耐药性金黄色葡萄球菌的耐药抑制作用 环丙沙星和氧氟沙星药敏纸片对对照组抑菌圈直径分别为16.38～17.89 mm和16.63～17.00mm之间；对经过复方黄连注射剂处理的试验组抑菌圈直径分别为27.60～30.26mm和29.50～30.60 mm之间；两组之间差异极显著（P＜0.01），耐药性金黄色葡萄球菌经复方黄连注射剂处理后对环丙沙星和氧氟沙星药物的敏感性大大提高，说明复方黄连注射剂具有明显的耐药抑制作用。一些研究报道表明，采用中西结合治疗，可提高抗菌药物和中药对耐药菌感染的治疗效果。如刘全离［7］等报道，耐先锋霉素Ⅴ的95号菌株单用先锋霉素Ⅴ 时抑菌圈直径为8mm，单用中药时抑制圈直径为12mm，中西药联合使用时抑菌圈直径扩大到19mm。王晓波［8］等报道，抗菌增效剂TMP与黄连素及蒲公英，鱼腥草联合作用后，可以明显增强细菌对TMP的敏感性。目前有关中药提取物或中药复方的体外抗菌作用研究报道比较多，但中药对耐药菌株的抑菌情况和耐药抑制作用如何，文献报道较少，本试验在这方面进行了初步尝试，为拓宽中药制剂的用药范围，减轻耐药菌株的用药压力，为耐药菌株的治疗寻找新的用药途径提供了一定的试验基础。

4 结语

复方黄连注射剂对耐药性金黄色葡萄球菌具有明显体外抑菌和耐药抑制作用。中药作为天然抗菌药物和耐药抑制剂将为解决急剧增多的耐药菌感染提供一个新的选择。

［1］张秋林，李家斌，李慧，等.2004年葡萄球菌对12种抗菌药物的耐药性［J］.中华医院感染学杂志，2006，16（10）：165-166.

［2］张致平.抗耐药菌药物研究进展［J］.中国临床药理学杂志，2003，19（1）：50-53.

［3］虞红，李英伦.中药逆转细菌耐药性的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2005，32（1）：54-56.

［4］M22A7and M72A5.National Committee for Clinical Laboratory Standards.Performance standars for antimicrobial susceptibility testing［S］.

［5］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2006.

［6］杨林富，项勋，段刚，等.中药黄荆提取物体外抑菌试验［J］.黑龙江畜牧兽医，2005，9：69-71.

［7］刘全离，龚志术.中西药联合作用对耐药菌体外抑菌效果观察［J］.中国消毒学杂志，2008，25（2）：50-53.

［8］王晓波，鞠玉琳.中药“连黄”对耐药金葡菌抑制作用的研究［J］.现代畜牧兽医，2007，10：10-11.