猪附红细胞体不同诊断方法的比较

潘树德，李学俭，张 良，席 东

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866）

附红细胞体病是由附红细胞体寄生于人和多种动物的红细胞表面、血浆及骨髓内的一种以红细胞压积降低、血红蛋白浓度下降和白细胞增多、贫血、黄疸、发热为主要临床特征的人畜共患传染病。目前猪的附红细胞体病己越来越引起我国养猪者的重视。近年来，我国猪附红细胞体病的发生和流行呈明显的上升趋势，有些省份为暴发性流行，尤其是对仔猪的危害更为严重。

2010年11月，沈阳市法库县某养猪户从外地购进体重约7.5～20kg，大小不一的仔猪110头，30 d后同群中较大的猪开始发病，后全群相继发病。就诊时已发病70头，死亡10头。

临床症状：病猪精神委顿，被毛粗乱，食欲不振，双眼无神，结膜苍白、贫血、黄疸明显；体温40℃～41.5℃，仔猪开始便秘，粪便前期干燥，后排下黄色稀粪，严重时呈水样；全身皮肤发红，耳尖、腹部、颈部及四肢有紫红色斑块，指压不退色，呼吸急促，流浆性、黏稠鼻液。

病理变化：剖检病死猪可见全身淋巴结水肿，切面边缘出血，断面呈大理石样花纹出血；脾脏边缘有梗死病灶；胃肠道均有不同程度的出血、充血，回盲口附近有轮层状、纽扣状溃疡灶；肾脏表面有针尖大小的出血点；部分膀胱黏膜有出血点；肝脏呈土黄色；胆汁黏稠；肌肉色淡；血液凝固不良。

根据临床症状和病理变化可初步诊断为猪瘟和附红细胞体的混合感染，现对猪附红细胞体的实验室诊断及该群猪的治疗叙述如下。

1 材料与方法

1.1 材料 血液样品 采自法库某农户猪场的病猪。

试剂：吖啶黄、枸橼酸、碱性品红、浓盐酸、瑞氏染液、姬姆萨染液、甲醇、磷酸氢二钠、偏亚硫酸钾、活性碳、固绿、吖啶橙等。

主要设备：OLYMPUS倒置显微镜；OLYMPUS荧光显微镜；普通光学显微镜。

1.2 方法

1.2.1 取病猪血 猪附红细胞体病待检血液采自自然发病的附红细胞体患猪的静脉血。

1.2.2 鲜血压片镜检 将1滴静脉血滴于载玻片上，加等量的生理盐水稀释，降低血浆黏度，防止血液中红细胞重叠密集，以便观察。在400倍显微镜下找到红细胞后，待血液停止流动后，即可观察。

1.2.3 姬姆萨染色 姬姆萨染色液的配制：取姬姆萨染料0.6g，加入50mL甘油内，于56℃下加热2 h，然后加入甲醇50mL，于3～5d后过滤，即为原液。使用时与各种pH值的PBS以1∶20的比例混合，即为染色液。

染色：无菌采取猪静脉血，与阿氏液1∶1混合。推片、干燥后用甲醇固定，待甲醇挥发干净后将玻片浸于不同pH值的染色缸中，每种pH值放4张，并分别于6、12、18、24h后进行观察。

1.2.4 瑞氏染色 瑞氏染色液的配制：取瑞氏染料0.1g置乳钵中，徐徐加入甲醇，研磨以促其溶解。将溶液倾入有色中性玻瓶中，并数次以甲醇洗涤乳钵，亦倾入瓶内，最后使全量为60mL即可。将此瓶置暗处过夜，次日过滤即成。

染色：推片自然干燥后，滴加瑞氏染色液，染色3min，然后加等量蒸馏水再染5min，蒸馏水冲洗。

1.2.5 吖啶橙染色 吖啶橙染色液的配制：将0.01g吖啶橙溶于100mL 0.05mol／L，pH值7.5的Tris-HCl缓冲液中。

染色：将涂有标本的玻片用甲醇固定，待甲醇挥发干净后将玻片置湿盒内，加适量吖啶橙染液，37℃、10min。用pH值7.4的PBS轻轻冲洗，溶液分色2min，用PBS洗涤2次，直接在荧光显微镜下观察。

1.2.6 治疗 对全群猪进行紧急免疫，用脾淋苗加免疫增效剂新必妥1∶1稀释后每猪肌肉注射2头份。

全群猪按阿莫西林250mg／kg加土霉素1000 mg／kg拌料连用7d，严重病猪用血虫净1g，用生理盐水稀释成5%浓度，每千克体重10mg，肌肉注射，每日1次，连用2d，隔日再肌肉注射1次。同时用复合维生素B和维生素C饮水。饮水中添加黄芪多糖粉和电解质。

整个猪场进行彻底消毒。用2%来苏儿溶液进行带猪消毒，5%来苏儿溶液用于场地、污物、周围环境消毒。隔日1次，连用1周。

加强饲养管理工作，驱除蚊、蝇、疥螨、虱等；调整饲养密度，改善饲养环境，保持猪舍安静。及时隔离病猪，病死猪作无害化处理。

2 结果与分析

2.1 直接血液压片镜检的结果 光镜下，可见多数红细胞表面及周围附有2～6个附红细胞体。红细胞呈淡灰色，附红细胞体发出绿色亮光。附红细胞体多数附着于红细胞表面单个或成团寄生，呈链状或鳞片状。少数呈点状位于红细胞的边缘或中央。严重感染病例的每个红细胞上附红细胞体可达20个以上，此时红细胞在光镜下犹如突起的蓖麻球和菠萝状。附红细胞体在血浆中呈游离状，常做摆动、扭转、翻滚、上升、下降等运动，一旦附着在红细胞上以后则停止运动，运动中以个体小者显得最活泼。若将血液存放于4℃冰箱中，72h内，血浆中的附红体及菠萝状的红细胞增多，经56℃水浴1min恢复至双凹状，血液中游离的附红细胞体大量增加，运动活泼，有的跳跃，有的做高 速旋转。如温度增至60℃时大部分附红细胞体停止运动，100℃1min全部停止.将含有菠萝状红细胞的血液在4℃冰箱中存放72h后取出，生理盐水洗涤3次，56℃水浴1min，将此500r／min离心取上清液，再3000r／min离心30min，弃上清取沉渣，见大量活动附红细胞体。

2.2 姬姆萨染色镜检的结果 不同pH值染色液对染色效果的影响，见表1。

表1 不同PH值染色液染色效果

由表1可以看出，在pH值8.0以上的碱性环境中，姬姆萨染料对附红细胞体的着色效果较好，附红细胞体着色较深，并且比较清晰，而在pH值8.0以下的环境中则着色不好。

染色时间对结果影响：染色6h或12h观察，整个血片着色不好，18h以上可获得满意效果，即镜下观察附红细胞体着色深，轮廓分明。姬姆萨染色后在红细胞表面上可见到0.5～1.5μm的紫红色颗粒，呈圆形、逗号状，每个红细胞上可出现多个。

2.3 瑞氏染色结果 红细胞和附红细胞体均为蓝紫色，附红细胞体着色较深。在星形红细胞的突出部位或红细胞表面，可见到圆形深染的颗粒状物，每个红细胞上有3～8个不等。

2.4 吖啶橙染色 在荧光显微镜下红细胞为暗淡的绿色，在大多数红细胞边缘及表面上可看到一些发亮荧光的小体，直径1μm左右，为被吖啶橙染色的附红细胞体。

2.5 治疗结果 3d后，病情逐渐好转，恢复食欲；5d后，基本采食；7d后，恢复正常，疫情得到控制。

3 讨论

3.1 血液压片相衬观察法 该方法操作程序简单，显微图像反差强烈，附红细胞体呈绿色亮光，容易观察，检出率高，在附红细胞体数量较少的情况下，于暗淡的背景中极容易看到发出绿色亮光的附红细胞体。缺点是对显微镜的性能要求较高，普通显微镜和性能欠佳的相衬显微镜，其观察效果常不理想。

3.2 瑞氏、姬姆萨染色法 染色程序简单，省时省事，染色标本中各种血细胞及附红细胞体的显微图像清晰，容易观察和判定。染色后的血液涂片如经脱水、封固可长期保存，有利于进行学术交流或作回顾性诊断。缺点是这种染色方法和其他常规的快速染色法均可产生人为假象（姬姆萨色素沉着），色素会附着在红细胞上，易被误认为附红细胞体。经姬姆萨染色后，有的正常红细胞边缘也有着色颗粒，无法与因附着有附红细胞体的而出现边缘着染的病变红细胞明显区别，而发生误判。在附红细胞体的数量较少时，还容易造成漏判。尽管如此，如果操作得当，这些染色法，仍不失为一般实验室进行病原学诊断较为适用的方法。标本以相衬显微镜观察时，显微图像反差强烈，在附红细胞体数量极少的情况下，于暗淡的背景中也极容易看到发出白色亮光的附红细胞体，而做出确切的诊断。

3.3 吖啶橙染色法 该方法属于荧光染色法的一种，吖啶橙可插入DNA和双链RNA的双螺旋结构内的碱基对之间，此染料是碱性荧光探针可与多核苷酸链上的酸性磷酸基团之间借静电结合。因此，它具有特异性强、检出率高、不易受红细胞形态学变化的影响等特点。即使附红细胞体的数量较少，以常规染色法难以做出诊断的血液标本，使用吖啶橙染色时，呈现明亮桔黄色的病原也容易与暗绿色的背景区别开来，从而做出明确诊断。该方法的不足之处是以荧光染料染色的标本不易保存，难以作回顾性诊断。

4 小结

4.1 通过对病料直接血液压片和制作血涂片染色镜检，结果表明，采集的病料感染了附红细胞体。

4.2 通过采取紧急免疫接种、药物防治、严格消毒和加强饲养管理等方法，3d后，病情逐渐好转，恢复食欲；5d后，基本采食；7d后，恢复正常，疫情得到控制。