桑黄漆酶的发酵条件研究初报*

雷 萍，吴亚召，张飞龙，张文隽，董艳鹤，王成章，宫 坤

（1.陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043；2.西安市生漆研究所，陕西 西安 710061）

漆酶（Laccases） 是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，该酶最早是在漆树的汁液中发现的，故将其命名为漆酶；此后在多种植物、高等真菌[1]、少数细菌及昆虫体内均有发现[2]。漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水，因此本质上是一种环保型酵素。由于这几年环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶也成为众多学者的研究对象。

漆酶独特的催化特性使其在生物检测中有广泛的应用，作为高效的生物检测器而成为底物、辅酶、抑制剂等成分分析的有效工具和手段，在生物制浆、生物漂白、以及有毒化合物的降解等方面具有潜在应用价值，因而引起人们越来越多的研究兴趣，成为环境保护用酶研究的热点[3]。近年来，人们对漆酶的研究越来越深入，其应用的范围也越来越广泛。

漆酶属于蓝-铜族氧化酶，其活性中心由4个铜原子组成，在氧化还原反应中起着决定作用。漆酶的Ⅰ型铜原子和氨基酸残基结合成为单核中心，是酶表现为明显的蓝色。另外，它还包含Ⅱ型和Ⅲ型铜原子，构成三核中心。Ⅰ型铜原子作为初级电子的接受者，参与分子内的电子传递，把电子从底物传递到其他铜原子上，然后电子结合于三核位点。该位点进一步把电子传递给结合活性中心的第二底物氧分子，使之还原为水，而铜的存在是形成复合体所必需的[4]。它们催化的反应是利用分子氧，产生的副产物只有水，所以又称漆酶为“生态友善酶”。

尽管漆酶在自然界中广泛分布，但真正具有较高漆酶产量的菌株并不多，分泌漆酶的真菌主要分布于担子菌（Basidiom ycotina）、多孔菌、子囊菌、脉胞菌（Neurospora）、柄孢壳菌和曲霉菌等属种，其中最主要的是担子菌亚门的白腐菌真菌，研究也较多[5，6]。但是大部分真菌发酵周期较长，使得工业化生产具有一定的局限性。

本研究室前期通过野外采集分离筛选获得1株桑黄菌[7]，目前还未见关于桑黄菌产漆酶的相关报道。本试验对其液体发酵进行了研究，初步筛选出适宜菌丝体生长的液体培养基配方，为进一步开发桑黄菌产品提供了技术依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

桑黄菌种来自于陕西省微生物研究所微生物资源中心第三研究室。

1.2 培养基

1.2.1 母种培养基

采用PDA综合培养基。

1.2.2 碳源测定

基础培养基：蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、Cu2+60 μmol·L-1[8]、VB110 mg·100-1·mL-1，pH 自然。

1.2.3氮源测定

基础培养基葡萄糖2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、Cu2+60 μmol·L-1，VB11 mg·100-1·mL-1，pH 自然。

1.2.4 试验培养基

将碳源基础培养基中的葡萄糖分别以蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米粉取代，进行碳源试验；将氮源测定基础培养基中的蛋白胨分别以酵母膏、麦麸、（NH4）2SO4、黄豆粉、尿素代替进行氮源试验。

1.2.5 优化培养基

试验以玉米粉（A）、葡萄糖（B）为复合碳源，以麦麸（C）、蛋白胨和酵母膏（D）为复合氮源，采取四因素三水平正交试验的方法对桑黄菌产酶液体培养基进行优化。

1.3 方法

1.3.1 菌种培养、发酵

将一级桑黄菌菌种0.5 cm2接种于装有100 mL培养液的300 mL三角瓶，28℃条件下，旋转频率150 r·min-1，28℃摇床培养8 d。

1.3.2 碳源筛选试验

将桑黄菌在6种不同碳源培养基中培养，每次试验重复5次，结果取平均值。

1.3.3 氮源筛选试验

将桑黄菌在6种不同氮源培养基中培养，每次试验重复5次，结果取平均值。

1.3.4 正交试验筛选最佳培养基配方

取一级桑黄菌菌种0.5 cm2分别接种于9种不同的正交试验培养基中，在温度29℃，摇床转速150 r·min-1条件下培养8 d，每次试验重复5次，结果取平均值。试验因素及其各水平见表1。

表1 L9(34)正交试验的因素及水平

1.3.5 粗酶液的制备、漆酶产量测定

发酵液10 mL经4 000 r·min-1、4℃离心15 min，弃去菌丝体，取得的上清液即为粗酶液。将1.0 mmol·L-1愈创木酚和50 mmol·L-1的琥珀酸（pH4.5） 配成缓冲液，取4 mL缓冲液和1 mL粗酶液，混匀，30℃恒温水浴反应30 min，在465 nm处测定吸光度，以灭活粗酶液和缓冲液作为对照，计算酶产量。酶活性单位（IU）定义：每分钟氧化1 μmol愈创木酚所需要的酶量[9]。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对产酶量的影响试验

在碳源基础培养基中分别加入各种碳源2%，进行碳源的筛选试验，试验重复5次，取每次产酶量平均值。结果见表2。

表2 不同碳源对桑黄发酵产漆酶的影响

从表2可以看出，桑黄发酵产漆酶以玉米粉作为碳源效果最好，其次是葡萄糖、蔗糖等。

2.2 不同氮源对产酶量的影响试验

在氮源基础培养基中分别加入各种氮源0.5%，进行氮源的筛选试验，试验重复5次，取每次产酶量平均值。结果见表3。

从表3可以看出，桑黄最适发酵用氮源为麦麸，其次是黄豆粉、蛋白胨、（NH4）2SO4等。

2.3 正交试验优化桑黄发酵产漆酶的培养基结果与直观分析

正交实验直观分析表见表4。

从表4可以看出9个处理中，处理2的产酶量最大7 666 U·L-1。由此得出较优的桑黄发酵生产漆酶培养基配方为玉米粉1%、麦麸1%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母膏 0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、Cu2+60 μmol·L-1，VB11 mg·100-1·mL-1。处理6次之，处理3、处理4较差。

表3 不同氮源对桑黄发酵产漆酶的影响

表4 L9(34)正交试验结果直观分析表

3 讨论

通过试验发现桑黄菌发酵生产漆酶最适碳源是玉米粉，氮源为麦麸。葡萄糖也可作为发酵碳源，但玉米粉价格低廉，本试验选择玉米粉做发酵碳源。

采用正交方法优化出了桑黄菌发酵生产漆酶的培养基配方。结果表明，玉米粉1%、麦麸1%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、Cu2+60 μmol·L-1、VB11 mg·100-1·mL-1。

[1]钞亚鹏，钱世钧.真菌漆酶及其应用[J].生物工程进展，2001，21（5）：23-28.

[2]Alexandre G,Zhulin IB.Laccases are widespread in bacteria[J].Trends in Biotechnology，2000，18 （2）：41-42.

[3]尹亮，陈章和，赵树进.白地霉产漆酶条件优化及对偶氮染料的脱色[J].华南理工大学学报：自然科学版，2008，36（12）：85-90.

[4]Faraco V,Giardina P,Palmieri G,et al.Metal-activated laccase promoters[J].Progress in Biotechnology，2002 （21）：105-111.

[5]李兵，王宇光.平菇漆酶与Cu2+调控关系的研究进展[J].安徽农业科学，2008（7）：2660-2661.

[6]赵林果，陆叶，谢慧芳，等.碳源和氮源对彩绒革盖菌液体发酵合成漆酶的影响[J].微生物学杂志，2007，27（5）：57-60.

[7]雷萍，孙悦迎，张文隽，等.野生桑黄菌种分离与培养特性研究初报[J].食用菌学报，2007，14（2）：71-75.

[8]王丽娟，何培新，李明丽.漆酶高产菌株的筛选及产酶条件优化[J].郑州轻工业学院学报，2010，25（4）：29-31.

[9]林俊芳，刘志明，陈晓阳，等.真菌漆酶的活性测定方法评价[J].生物加工过程，2009，7（4）：1-8.