肠易激综合征大鼠内脏高敏感性与脑肠互动的研究

唐庆林，宫秀群，冯根宝，李雪飞，汪芳裕

(本文编辑:张仲书; 英文编辑:王建东)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种以腹痛或腹部不适伴排便习惯改变和(或)粪便性状改变的功能性肠病，缺乏可解释症状的形态学和生化学异常［1-2］。IBS的病因和发病机制尚不明确，内脏高敏感性(visceral hypersensitivity，VH)和脑肠互动(brain-gut interaction，BGI)是当前的研究热点［3-4］。本研究通过建立腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，DIBS)大鼠模型，探讨VH与BGI在IBS发病和病理生理学中的可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠24只，体重270～310 g，南京军区南京总医院比较医学科提供，许可证号:SCXK(军)2007-012。

1.2 动物模型及指标检测

1.2.1 模型建立 大鼠24只，随机分为模型组(A组)和对照组(B组)，每组各12只，按参考文献［5］方法建立模型，实验方案得到南京军区南京总医院实验动物伦理委员会的批准。实验前，大鼠正常饮水，禁食12 h后将其置于固定器(苏州苏杭公司，5 cm×5 cm×20 cm)内，以头低尾高位固定，经肛门插入自制大鼠灌肠管至距肛门8 cm，缓慢灌入4%乙酸(成都科龙试剂厂)1 ml，用浸湿生理盐水的棉签压迫肛门口约30 s(防止液体溢出)，再予1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗肠道后缓慢拔出灌肠管，后正常饲养6 d。B组用生理盐水代替乙酸灌肠。第7天评价模型并取材。

1.2.2 直结肠扩张实验(colorectal distension，CRD) 实验第6天禁食24 h，禁水12 h;第7天，两组大鼠分别于清醒状态下放入大鼠固定器中，参考文献方法［5］，将8F导尿管(Euromedical公司，导管直径2.7mm，球囊最大容量3ml)经肛门缓慢插入，气囊末端距肛门约2 cm并固定。待30 min后大鼠适应，经外口气囊内先后注入37℃生理盐水(0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 和 1.0 ml)扩张，按腹部回撤反应(abdominal withdrawl reflex，AWR)标准［5］评分，每4分钟一次，每次约30 s，每一个评分重复3次，取平均值。

1.2.3 Bristol粪便性状评分 实验第7天观察大鼠粪便情况并按文献标准［2］评分，其中4、5级为正常，其余为异常。

1.2.4 小肠推进实验 实验第7天，每只大鼠予印度墨汁0.3 ml灌胃，20 min后，腹腔注射3%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，剖腹游离出小肠(十二指肠始端至回盲部)平铺于白纸上，记录印度墨汁在小肠中移行距离及整段小肠长度，以印度墨水在小肠中移行距离占整段小肠长度的百分比值，作为小肠推进百分率来评价小肠推进运动情况。

1.2.5 标本采集、病理切片及免疫组化染色 实验第2天，随机取A组及B组大鼠各2只，麻醉后取大鼠结肠(距肛门约10 cm处)1 cm肠段，常规HE染色。其余大鼠第7天麻醉后予心脏穿刺插管至主动脉根部，剪破右心耳，以生理盐水200ml快速灌注冲洗，待冲洗液清亮后，予多聚甲醛缓冲液(40 g/L)250 ml固定。取出完整大脑、脊髓(L4～6)、结肠(距肛门约10 cm处)1 cm肠段，以10%甲醛固定后常规石蜡包埋，结肠及脊髓连续切片，脑组织按前囟后方1.5 mm至5.0 mm连续冠状切片，自大脑正中至左2.0 mm连续矢状切片，片厚4μm，隔5张取1张。每例每部位取2张，置于防脱载玻片上，烤箱60℃ 30 min使切片紧密黏附。使用浓度为1∶100稀释的c-fos抗体(北京博奥森生物公司)，按SP法免疫组化法进行标记，按说明书操作。染色结果分析:在光学显微镜下，每张切片在400倍镜下随机取3个视野，用Image Pro Plus 5.0.2图像分析软件测定各组切片中抗体呈阳性反应的细胞数、累计光密度(integrated optical density，IOD)进行半定量分析，IOD值代表组织染色强度，IOD值越大，代表染色越强。所有大鼠结肠免疫组化操作前行常规HE染色。

2 结果

2.1 CRD 结果 当容量扩张≥0.3 ml时，A 组AWR评分明显高于B组(P＜0.05，表1)。A组内比较，容量扩张分别为 0.1 ml、0.2 ml、0.3 ml、0.4 ml时，组内对应AWR值比较，差异有统计学意义(P ＜0.05)，容量扩张分别为 0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml时，组内对应的AWR值比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，说明容量扩张达0.6 m l时，肠道致敏达一定阈值，但与B组比较，两组差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 两组大鼠AWR评分比较(±s)

表1 两组大鼠AWR评分比较(±s)

注:组内比较，*P ＜0.05;与 B 组同期比较，△P ＜0.05

容量(/ml) A组 B组0.1 0.20 ±0.42*0.00 ±0.00 0.2 0.80 ±0.63* 0.20 ±0.42 0.3 1.70 ±0.48＊△ 0.40 ±0.52 0.4 2.60 ±0.52＊△ 1.20 ±0.42 0.6 3.30 ±0.48△ 2.00 ±0.00 0.8 3.30 ±0.48△ 2.00 ±0.00 1.0 3.60 ±0.52△2.60 ±0.52

2.2 Bristol评分 A组大鼠粪便多为稀便或糊便状，其 Bristol评分为(5.80±0.42)，而 B 组大鼠粪便多为团块状或腊肠样，其Bristol评分为(4.00±0.82)，两组差异有统计学意义(P ＜0.05)，且 A 组符合D-IBS。

2.3 小肠推进试验结果 A组小肠推进百分率为(70.58 ±5.11)%，B 组为(54.92 ±4.38)%，两组差异有统计学意义(P＜0.05)，A组小肠推进较B组显著要快。

2.4 结肠外观变化及HE结果 造模后第2天，与B组相比，A组大鼠结肠外观管腔增大，管壁增厚，伴充血及出血，镜下可见黏膜层、黏膜下层水肿明显，出现片状出血点。实验第7天，两组肠黏膜外观及HE染色均无异常。

2.5 免疫组化结肠、脊髓背角、海马、下丘脑c-fos表达 与B组相比，A组结肠可见较多细胞胞浆呈棕褐色的c-fos阳性细胞，主要分布于黏膜层(图1);脊髓背角可见大量胞浆棕色的c-fos阳性神经元细胞;下丘脑、海马可见多个胞浆褐色的c-fos阳性神经元细胞，与B组相比，细胞数目及IOD值明显增高(P ＜0.05，表2)。

3 讨论

IBS是临床常见的一组消化系统症候群，其病因及发病机制尚无定论。VH是指内脏组织器官对刺激的感受性增强的现象，越来越多的研究表明，VH是IBS主要的病理生理特征［6］。由于IBS是一种功能性胃肠病，取得患者的脑和脊髓等组织进行研究相对困难，利用动物模型则可为研究提供良好的基础和条件。应用较广泛的模型主要是通过化学或机械刺激造模，目前常用的大鼠模型有成年大鼠直肠化学刺激［5］、幼鼠肠道化学刺激［7］等。本实验选用成年大鼠乙酸灌肠造模模拟人类D-IBS，当CRD容量扩展≥0.4ml时，A组AWR评分≥2分，达到伤害感受疼痛阈值时［5］，符合 VH，与 B组相比，实验数据的差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 免疫组化结肠、脊髓背角、海马、下丘脑c-fos表达(SP×400)

表2 两组大鼠c-fos表达比较(±s)

表2 两组大鼠c-fos表达比较(±s)

注:与B组同部位比较，*P＜0.05

部位细胞数目A组 B组IOD值A组 B组结肠 63.80 ±7.71* 53.20 ±6.03 4630.76 ±920.99*3003.67 ±949.19脊髓背角 13.20 ±1.93* 9.20 ±1.55 6675.18 ±2.08* 1963.77 ±1.84下丘脑 61.70 ±5.03* 51.40 ±5.36 2595.18 ±773.86* 1461.58 ±420.18海马 164.80 ±9.13* 151.80 ±7.41 614.94 ±144.33*319.28 ±121.05

高级神经中枢与肠道的相互作用称为“脑肠互动(BGI)”，BGI概念的提出有助于我们进一步理解IBS的发病机制［8］。c-fos是一种存在于神经细胞内的即刻早期基因，在感觉通路中表达。当机体受到刺激时，其表达会有所改变，目前其在BGI研究中成为关注热点［9］。本研究利用c-fos在活体受到外界伤害刺激后，其表达产物可作为伤害性感受神经元兴奋的标志物的原理［10］，利用免疫组化的方法检测脑、脊髓背角、结肠各层面c-fos的表达和分布，以初步探讨VH与BGI的关系。IBS内脏高敏感的形成是一个复杂的过程，脑肠轴多个层面均参与其中，肠道刺激作用外周感受器后，经神经元传递至中枢。脊髓背角是内脏感觉传入纤维的汇聚之所，是肠道与中枢信号传递的“中继站”，在脑-脊髓-结肠互动中起重要作用。本研究中，模型组大鼠呈现内脏高敏感，各层面c-fos表达均升高，推测可能是化学刺激导致肠道炎症，内脏感受器激活，中枢神经系统对外周信号放大、致敏，肠道传入脊髓伤害性信号增多，导致脊髓背角神经元兴奋性升高，经神经传递至脑。虽然肠道有炎症自我修复功能，但中枢自我恢复能力不如肠道，仍通过下行通路作用于脊髓背角，影响内脏感觉。另外，本研究结果表明，模型组内脏高敏感，下丘脑、海马、脊髓背角、结肠的c-fos阳性细胞表达升高，与对照组比较差异有统计学意义。海马和下丘脑c-fos表达量明显升高，提示这两个部位可能在高级中枢致敏中起重要作用，这可能与这两个部位的功能有关。

综上所述，我们的初步研究表明，BGI与VH有一定关系，c-fos参与VH的调节，这为深入研究IBS发病机制乃至治疗提供了新的思路。

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