ECRG4基因在人胃腺癌组织中的表达及意义

方 圆，马 党，危文素，徐 镭，付 泊，刘 展

（湖南师范大学第一附属医院，湖南省人民医院消化内科，湖南 长沙 410005）

食管癌相关基因4(Esophageal Cancer Related Gene 4，ECRG4)是我国协和医科大学肿瘤研究所于1998年首次克隆和鉴定的食管癌相关新基因，并在Genbank(AF268198)登记[1]。ECRG4在人体正常组织中广泛表达，Northern blot分析表明，ECRG4在所有检测的组织中包括心、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾、前列腺和胰腺等都表达[2]。研究显示，ECRG4是新的候选抑癌基因，是多种肿瘤预后的候选标志物，ECRG4不仅仅是与肿瘤的生长与侵袭有关，同样也与细胞的变异和凋亡有着密不可分的联系[2-5]。启动子高甲基化是ECRG4在肿瘤发生过程中转录失活的主要机制[6]。ECRG4可能通过参与NF-κB通路调控COX-2的表达来发挥其抑癌功能[7]。ECRG4基因与胃腺癌的发生发展的相关性研究，目前国内外尚无报道。本研究通过免疫组织化学的方法研究ECRG4基因在胃腺癌组织、癌旁组织及正常胃组织中的表达差异及其与患者临床病理特征的相关性，从而为胃癌的基因诊治及分子靶向治疗提供新的思路和依据。

1 材料和方法

1.1 材料

收集湖南省人民医院2009年1月～2011年12月胃癌手术后病理科保存胃癌石蜡标本58例作为胃癌组，其中男性36例，女性22例。年龄30～80岁(平均57.95岁)。收集癌旁组织(距肿瘤边缘2～5cm取材)15例作为癌旁组、同期术后证实为良性疾病的胃组织15例作为正常组。所有标本均有临床病理资料记录相匹配。所有标本均经过病理诊断证实，患者术前均未接受放化疗。ECRG4多克隆抗体(Rabbit anti-ECRG4，Catalog C11679) 购自 Assay-Biotech公司；即用型非生物素免疫组化EliVisionTMsuper检测试剂盒(KIT-9923)、DAB显色剂、柠檬酸抗原修复液及PBS缓冲液粉剂等均购自福州迈新生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 制片及资料分类

全部石蜡标本连续切片，切片厚度4 μm，首先经HE染色病理组织学证实后再采用免疫组织化学SP法检测胃癌组织、癌旁组织及正常胃组织ECRG4表达。严格按照试剂盒说明书所示步骤操作，取ECRG4一抗稀释浓度为1:50。用PBS代替一抗作为阴性对照，用食道组织切片作为阳性对照。试验组所有病例均根据国际抗癌联盟第4版胃癌TNM分期系统标准进行分期，按性别、年龄、肿瘤发生部位、组织分化程度、是否有淋巴结转移进行分类。

1.2.2 阅片及判定标准

采用半定量分析，显微镜下随机选取5个视野观察，按阳性着色范围和阳性着色强度分别计分：阳性范围无为 0分，＜30%为1分，31%～60%为2分，＞60%为3分；阳性强度弱(基本不着色)为0分，中(淡黄色)1分，强(棕黄色)2分，极强(棕黑色)3分。阳性范围和强度的评分相乘，即为阳性积分，取5个视野的平均阳性积分为该例的阳性积分；每例阳性积分0～1分为阴性，2分为弱阳性，3分为阳性，4分及以上为强阳性。

1.2.3 统计学处理

用SPSS19.0软件进行统计学分析,定性资料率的比较采用卡方检验;非参数检验用Wilcoxon秩和检验、Kruskal-Wallis H检验，以α=0.05作为检验水准。

2 结果

2.1 ECRG4蛋白在胃癌组织、癌旁组织及正常胃组织的表达特点

ECRG4蛋白在胃腺癌组织中表达明显下调或缺失，在癌旁组织中部分下调或缺失，而在胃正常组织普遍表达。光学显微镜下可见淡黄至棕黄色着色即为阳性表达，主要定位于细胞质、细胞膜。ECRG4蛋白在胃癌组中阴性表达29例、弱阳性表达29例、未见阳性及强阳性表达；癌旁组织中阴性表达0例、弱阳性表达5例、阳性表达7例、强阳性表达3例；正常胃组织中阴性表达1例、弱阳性表达4例、阳性表达2例、强阳性表达8例(图1)。三者比较以秩转换的非参数检验Kruskal-Wallis H检验得P＜0.001，可认为胃癌组织、癌旁组织及正常胃组织ECRG4蛋白表达有差别。组间两两比较以Wilcoxon秩和检验得正常组与胃癌组、癌旁组与胃癌组均有统计学意义（P＜0.001），可认为胃癌组织与正常胃组织、胃癌组织与癌旁组织ECRG4蛋白表达有差别。而正常组与癌旁组比较，P＞0.05，认为正常胃组织与胃癌癌旁组织ECRG4蛋白表达无统计学差异。

图1 IHC所示ECRG4蛋白在胃腺癌、癌旁及正常胃组织中的表达

2.2 ECRG4蛋白表达与胃腺癌患者的临床病理特征的关系

ECRG4的表达与胃癌患者的分化程度有关，分化程度越低者其表达缺失率越高 (χ2=8.357，P＜0.05)。ECRG4蛋白表达与病人年龄、性别、肿瘤发生部位、TNM分期及是否淋巴结转移无关 (χ2=0.284～2.636，P＞0.05)，见表 1。

3 讨论

食管癌相关基因4(ECRG4)是我国协和医科大学肿瘤研究所首次克隆和鉴定的食管癌相关新基因，并在Genbank(AF268198)登记，苏涛[1]等利用差异显示PCR(DD-PCR)法，比较了取自河南林县高癌家族的食管癌组织和对应癌旁正常组织标本，分离出4条表达差异的表达序列标签 (expressed sequence tag，EST)片段，命名为食管癌相关基因1-4(Esophageal Cancer Related Genes，ECRG1-4)。 毕美霞[8]等采用RACE技术和计算机克隆两种方法分离和鉴定了ECRG4 cDNA的全长，得到一致的结果，并在Genbank(AF268198)登记。NCBI将与ECRG4来源于同一基因的EST序列归为一个唯一序列族(Unigene Cluster)Hs.43125，该序列族存在从同一始祖进化而来的两种定向进化同源基因Mm.11819(Unigene Cluster，Mus musculus) 和 Rn.16593(Unigene Cluster，RAT)。 ECRG4 基因定位于 2q12.2，全长跨度约12,500bp，含有一个444bp的完整编码框和四个外显子，编码由148个氨基酸组成的多肽，ECRG4蛋白约17KD。激光扫描共聚焦显微镜成像显示，内源性和外源性ECRG4蛋白主要定位在细胞质和细胞膜。ECRG4在人体正常组织中广泛表达，Northern blot分析表明，ECRG4在所有检测的组织中包括心、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾、前列腺和胰腺等[2]都表达。

研究显示，ECRG4是新的候选抑癌基因，是多种肿瘤预后的候选标志物。ECRG4不仅仅是与肿瘤的生长与侵袭有关，同样也与细胞的变异和凋亡有着密不可分的联系[2-5]。研究表明，启动子高甲基化是ECRG4在肿瘤发生过程中转录失活的主要机制[6]。ECRG4可能通过参与NF-κB通路调控COX-2的表达来发挥其抑癌功能[7-8]。ECRG4重组蛋白可作为某些肿瘤的潜在治疗药物。ECRG4能够延缓细胞周期进程，如神经胶质瘤细胞U251、食管癌EC9706等的研究中，ECRG4的作用主要表现在从细胞G1期到S期延缓细胞周期进程，抑制细胞的迁移力和侵袭力[9-10]。

胃癌(carcinoma of stomach)是起源于胃上皮的恶性肿瘤，是最常见的恶性肿瘤之一。世界上不同国家与地区胃癌的发病率有明显差别。我国属胃癌较高发病区，但各地也有较大差异。尽管在过去的数十年中，在胃癌的诊断和治疗方面有了较大进展，但是胃癌的5年生存率仍然很低。因此，了解胃癌的病因及加强胃癌的预防对于胃癌的早期发现、早期诊断、早期治疗至关重要。胃癌的病因和发病机制尚未阐明，研究资料表明胃癌的发生是多因素作用的结果。目前认为与环境、感染、遗传、基因调控、癌前期变化等有关[11]。胃癌的发展经历一个相当漫长的演变阶段，既有阶段性又有连续性，涉及多种癌基因、抑癌基因、生长因子及其受体、细胞粘附分子及DNA修复基因等的异常和积累[11]。

ECRG4基因与人胃癌的发生、发展的相关性目前国内外尚未见研究报道。本试验通过免疫组织化学的方法首次初步研究了ECRG4蛋白在人胃腺癌组织、癌旁组织及正常胃组织的表达差异，结果以半定量的方法经过统计学检验比较后发现，ECRG4蛋白在胃腺癌组织中表达明显下调或缺失，在癌旁组织中部分下调或缺失，而在胃正常组织普遍表达。光学显微镜下阳性表达主要定位于细胞质、细胞膜。ECRG4蛋白在胃癌组中阴性表达29例、弱阳性表达29例、未见阳性及强阳性表达；癌旁组织中阴性表达0例、弱阳性表达5例、阳性表达7例、强阳性表达3例；正常胃组织中阴性表达1例、弱阳性表达4例、阳性表达2例、强阳性表达8例；胃癌组织、癌旁组织及正常胃组织ECRG4蛋白表达差别具有统计学意义。组间两两比较胃癌组织与正常胃组织、胃癌组织与癌旁组织ECRG4蛋白表达有差异。而正常组与癌旁组比较，ECRG4蛋白表达无统计学差异。与临床病理相联系显示，ECRG4的表达与胃癌患者的分化程度有关，分化程度越低者其表达缺失率越高,ECRG4蛋白表达与病人年龄、性别、肿瘤发生部位、TNM分期及是否淋巴结转移无关。

抑癌基因的失活导致正常细胞逐步向恶性表型转化一直是近年来的研究热点。ECRG4可能通过阻断异常的NF-κB通路的激活，抑制COX-2的表达和功能来发挥其抑癌作用[7]。ECRG4作为新的人类肿瘤的候选抑癌基因，为相关肿瘤的基因治疗提供了新的方向和实验依据，但ECRG4发挥作用的信号传导通路及与之直接作用的因子或基因尚不清楚，有关其具体的作用方式还需进一步探讨，本研究初步探讨了ECRG4在胃腺癌的表达情况，旨在为胃癌的基因诊治及分子靶向治疗提供新的思路和依据。

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