慢性乙型肝炎患者外周血Th17细胞的表达及临床意义＊

孙 强，汤 伟△，汪晓莺

（1.南通大学附属医院感染科，江苏南通226001；2.南通大学医学院免疫学教研室，江苏南通226001）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性流行，但不同地区HBV感染的流行情况存在很大差异。据WHO报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化及原发性肝细胞癌［1］。HBV体内持续感染导致慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的机制尚未完全阐明，白细胞分化抗原 （cluster of differentiation，CD）4阳性T细胞与CHB的关系引起人们的注意，并发现辅助性T细胞（helper T cell，Th）1／Th2平衡失调及调节性 T细胞（regulatory T cell，Treg）功能异常可促进CHB的发生、发展及恶化［2－3］。近年来研究人员发现了一群不同于Th1、Th2及Treg的细胞亚群，它们不表达白介素（interleukin）－4或干扰素（interferon，IFN）－γ，却大量分泌IL－17，被命名为 Th17细胞［4－5］。新近研究报道，Th17细胞在感染性疾病、自身免疫性疾病以及肿瘤中均发挥重要的调节作用。目前，Th17细胞是否参与HBV感染后CHB的发生、发展，它与肝脏的炎症损伤是否存在内在联系等均未见报道。本研究拟通过观察CHB患者外周血Th17细胞频率、血清IL－17水平及其与临床指标的相关性，探讨Th17与CHB的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择29例南通大学附属医院感染科门诊和住院确诊的CHB患者作为CHB组，其中，男17例，女12例；年龄17～56岁，平均37.8岁。诊断参照2005年中华医学会肝病学分会、感染病学分会修定的《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准。所有病例均除外其他病毒性肝炎、酒精性肝病、药物性肝炎、自身免疫性肝病及遗传性肝病等，且未经任何抗病毒或免疫调节药物治疗。另选17例健康体检者作为对照组，其中，男10例，女7例；年龄18～51岁，平均32.9岁；均无肝炎病史，肝炎病原学血清标志物检测为阴性，肝功能各项指标正常。

1.2 主要试剂与仪器 主要试剂：IL－17A－PE、CD4－PerCPCy5.5抗体及同型对照购自美国eBioScience公司，佛波醇酯、离子霉素及布雷菲德菌素 A（Brefeldin A，BFA）购自瑞士Alexis公司，Fix＆Perm（Reagent A、Reagent B）为美国Invitrogen公司产品，IL－17酶联免疫吸附测定（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自上海依科赛生物制品有限公司，HBV血清标志物ELISA试剂盒购自厦门英科新创科技有限公司，HBV核酸扩增荧光定量检测试剂盒购自中山达安生物技术有限公司，丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒为日本协和医药株式会社产品。主要仪器：流式细胞仪（美国BD公司）、Rotor－Gene荧光实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪及7600型全自动生化分析仪（日本日立公司）。

1.3 外周血Th17细胞频率的检测 采集健康人和CHB患者全血100μL（新鲜肝素钠抗凝），用RPMI 1640培养基100μL稀释，加入1μg／mL佛波醇酯工作液5μL，50μg／mL离子霉素工作液4μL及0.5mg／mL BFA工作液4μL。37℃、5%CO2培养箱培养6h。加入CD4－PerCP－Cy5.5抗体10μL，室温避光温育15min。将其分为2管，每管100μL，编号为a和b。分别加入Fix＆Perm中的Reagent A（即固定液）100μL，室温、避光温育15min，分别加入磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）3mL，离心5min（离心半径8cm，1 200r／min），弃除上清液。分别加入Fix＆Perm中的Reagent B（即破膜和溶血液）100μL，同时在a管中加10μL鼠IgG，b管中加入10μL IL－17A－PE，室温、避光温育15min。每管加PBS 3mL，离心5min（离心半径8cm，1 200 r／min），弃除上清液。加入0.5mL PBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测。

1.4 血清细胞因子IL－17水平的检测 采用ELISA法检测CHB患者和健康人外周血血清IL－17的水平，严格按试剂盒说明书进行检测。

1.5 血清HBV DNA、HBV标志物、ALT的检测 采用荧光实时定量PCR法检测患者血清HBV DNA水平；ELISA法检测HBV标志物；采用速率法检测血清ALT（日立7600型全自动生化分析仪）。

1.6 统计学处理 应用SPSS11.5软件进行统计学分析，计量数据用±s表示。组间Th17细胞频率、IL－17水平的比较采用两独立样本的t检验；血清ALT水平与Th17细胞，HBV DNA与Th17细胞的相关分析采用Pearson相关检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 外周血Th17细胞频率的检测 采用流式细胞术多色荧光分析法检测外周血Th17细胞频率，CHB组患者和对照组健康体检者外周血Th17细胞频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。将CHB患者分为 HBV e抗原（HBV e antigen，HBeAg）阳性组与HBeAg阴性组，两组患者外周血Th17细胞频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），结果见表1。对照组中1例健康体检者和CHB组中1例CHB患者外周血Th17细胞频率分别为9.20%和12.11%，见图1、2。

表1 各组人员外周血Th17细胞频率、血清IL－17水平的比较（±s）

表1 各组人员外周血Th17细胞频率、血清IL－17水平的比较（±s）

＊：P＜0.05，与对照组比较。

组别 n Th17频率（%） IL－17（ng／mL）对照组17 9.18±1.20 4.15±1.59 CHB组 29 11.58±1.85＊ 6.32±2.44＊HBeAg阳性组 16 12.17±1.62 6.26±2.68 HBeAg阴性组13 10.85±1.92 6.38±2.20

2.2 外周血中血清IL－17水平的检测 CHB组患者和对照组健康体检者外周血血清IL－17水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。将CHB患者分为HBeAg阳性组与HBeAg阴性组，两组患者外周血血清IL－17水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），结果见表1。

图1 对照组（1例）外周血Th17细胞频率

图2 CHB组（1例）外周血Th17细胞频率

2.3 CHB患者Th17细胞频率与HBV DNA载量、血清ALT的直线相关性分析 CHB组患者外周血Th17细胞频率与血清ALT水平正相关（r＝0.582，P＜0.01），而 Th17细胞频率与 HBV DNA载量无明显相关性（r＝－0.213，P＞0.05）。

3 讨 论

HBV在机体持续性感染所致CHB发生的机制尚未完全阐明。HBV是一种非细胞毒性病毒，当其进入机体后常可引起一系列复杂的免疫反应，而机体产生免疫应答的强弱又与HBV感染所致的不同临床结果密切相关。在这一系列免疫应答中，细胞免疫应答是决定HBV感染后疾病转归的重要因素，不同T细胞亚群对病毒抗原的反应不同，即对病情轻重及疾病转归的影响不同。目前的研究认为，HBV造成的肝损害及其转归与机体的细胞免疫关系密切，其中T淋巴细胞作为主要的效应细胞，与病毒的清除和肝细胞的损伤直接相关［6］，效应CD4＋T细胞是机体免疫应答的重要成员，并在免疫调节中发挥关键作用。效应CD4＋T细胞只有在应答恰当时，才能建立有效的宿主免疫体系并维持免疫记忆。但如果效应CD4＋T细胞失调，则会导致机体产生严重的炎症性损伤，如自身免疫疾病和自身炎症性疾病等。

根据细胞的功能，将CD4＋T细胞分为Th1、Th2细胞及Treg细胞3个亚群［7－8］。最近人们发现一群不同于Th1、Th2及Treg的细胞亚群，它们不表达IL－4或IFN－γ，却高表达IL－17，因此，命名为Th17细胞。Th17细胞主要通过其分泌的细胞因子IL－17A、IL－17F、IL－6、IL－22及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF－α）等发挥作用，其中最主要的是IL－17A，也称为IL－17，其受体在体内广泛表达。IL－17是一种重要的炎症介质，它可通过诱导其他炎症细胞因子，如IL－6、TNF－α及趋化因子等的表达介导炎症细胞的局部浸润及组织损伤；IL－17也参与中性粒细胞、树突状细胞的增殖、成熟及趋化过程［9］。Th17细胞在多种疾病中发挥着重要的效应作用。在感染性疾病中，Luzza等［10］发现胃、十二指肠幽门螺旋杆菌感染后外周血IL－17水平增加；牙周炎也出现血清IL－17表达水平的升高，这些提示IL－17参与了细菌感染后的炎症反应［10－11］；在肿瘤方面，有学者发现胃癌患者外周血 Th17细胞及其相关因子IL－23、IL－17明显高于健康人，且外周血Th17细胞频率与胃癌的分期有关，晚期胃癌患者频率较高［12］；在自身免疫性疾病中，研究人员发现溃疡性结肠炎和克罗恩病患者炎症急性期的肠黏膜内有大量Th17细胞存在；在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症以及炎症性疾病中Th17细胞发挥了重要的调节作用；同时Th17细胞也与自身免疫性血液病如再生障碍性贫血有密切关系。另外，有研究发现急性冠状动脉综合征患者外周血Th17细胞频率增加，IL－17、IL－23水平升高，Th17细胞可能参与不稳定动脉粥样斑块和急性冠状动脉综合征的发病［13－16］。

本实验对CHB患者外周血Th17细胞频率及其分泌的IL－17变化进行研究，结果表明CHB患者外周血Th17细胞频率明显高于健康人群，同时CHB患者外周血IL－17水平也明显高于健康人群，提示CHB患者体内存在较多的Th17细胞及其相关分泌因子的高表达。为探讨Th17细胞及其细胞因子在CHB发病过程中的作用，本实验进一步对CHB患者组外周血血清HBV DNA载量、ALT进行检测，发现CHB患者组外周血Th17细胞频率与血清ALT水平正相关（P＜0.01），这一现象提示CHB患者Th17细胞通过大量分泌IL－17发挥生物学作用，诱导中性粒细胞、巨噬细胞的聚集，加重肝脏损害。而CHB患者外周血Th17细胞频率与HBV DNA载量无明显相关性，提示Th17细胞的多少与病毒含量的直接关系并不大，但其与病毒感染后引起的免疫反应或组织损伤有关。

综上所述，本研究初步表明Th17细胞可能在CHB的发生、发展中发挥重要作用，但Th17细胞的功能、分布特点及其与CHB持续感染的免疫机制还有待进一步探讨。

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