腺嘌呤致大鼠睾丸损伤中标志酶的变化及淫羊藿总黄酮的干预作用＊

张作涛，谢高宇，陈 凯，齐敏友，刘浩然

（1.贵阳中医学院基础医学院解剖学教研室 550002；2.浙江工业大学药学院药理教研室，杭州310042；3.湖南大学化学化工学院药理学教研室，长沙410082）

腺嘌呤为制作慢性肾功能衰竭动物模型的常用试剂［1］，但研究发现它也可造成下丘脑－垂体－性腺轴的损害，引起睾丸退行性病变［2］。淫羊藿为补肾壮阳的常用中药。本实验以中药化学技术提取分离淫羊藿的总黄酮成份，干预腺嘌呤所诱导的大鼠睾丸病变，观察其药物疗效。

1 材料与方法

1.1 药物、主要试剂及仪器 腺嘌呤（Adenine）为美国AMRESCO公司产品，由南京生兴生物技术有限公司分装（批号：1012S07）。淫羊藿总黄酮（total flavonoids of herba epimedii，TFE）由湖南中医药大学科研中心提供，含总黄酮达77.4%；维生素E购自西南合成制药股份有限公司（批号：101214）；甲基睾酮购自天津飞鹰制药股份有限公司（批号：101103）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、γ－谷氨酰转肽酶（gamma－glutamyl transpeptidase，γ－GT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）试剂盒由南京建成生物工程有限公司提供。睾酮、促卵泡成熟激素（follicle－stimulating hormone，FSH）、促黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）检测试剂盒由天津九鼎生物工程有限公司提供。主要仪器包括SP－752分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、HH－4数显恒温水浴箱（金坛环宇科学仪器有限公司）、GC－1200γ放射免疫计数器（科大创新股份有限公司中佳分公司）。

1.2 TFE的提取 小檗科植物淫羊藿经石油醚脱脂，以70%乙醇提取，聚酰胺柱层析分离［3］。以盐酸－镁粉法及薄层层析初步检识为黄酮类。参照中国药典TFE测定方法，以淫羊藿苷为参照化合物，采用紫外分光光度法在270nm处检测总黄酮含量为77.2%。

1.3 腺嘌呤致大鼠睾丸病变模型的制作 Sprague Dawley雄性大鼠70只，180～220g，由浙江医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（浙）2008－0033。将其随机分为5组：正常对照组、模型组、TFE组、维生素E组和甲基睾酮组，每组14只。除正常对照组外，其余每组大鼠均予腺嘌呤150mg／kg灌胃，1次／d，连续14d，建立大鼠睾丸病变模型［4］。从第15天开始，正常对照组与模型组大鼠予蒸馏水灌胃。TFE组、维生素E组和甲基睾酮组大鼠分别予TFE 100mg／kg，维生素E 10mg／kg及甲基睾酮5mg／kg灌胃，均1次／d。30d后处死大鼠，检测相关指标。

1.4 观察指标

1.4.1 脏器指数 处死大鼠，取出睾丸、附睾、精囊腺，精密称量上述脏器及大鼠质量并计算脏器指数，脏器指数＝脏器质量／体质量。

1.4.2 生化检测 取大鼠血清以放射免疫法检测睾酮、FSH及LH含量。取同一侧睾丸组织以生理盐水制成匀浆，检测LDH、ACP、γ－GT、SOD、GSH－Px活性及 M DA含量。

1.5 统计学处理 采用PASW18.0软件进行统计学分析，计量数据用±s表示，组间比较采用单因素方差分析（one－way ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TFE对性腺及附属性器官脏器指数的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠睾丸、附睾、精囊腺与体质量的比值（脏器指数）均有下降（P＜0.05），其中睾丸、精囊腺的脏器指数下降较为明显。与模型组比较，TFE组、维生素E组及甲基睾酮组大鼠睾丸指数分别提高35.9%、25.3%及38.5%；TFE组及甲基睾酮组大鼠精囊腺指数分别提高43.5%、34.4%；TFE组、维生素E组及甲基睾酮组大鼠的附睾指数略有提高，但无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

2.2 TFE对睾丸中γ－GT、LDH、ACP及睾酮的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠睾丸中γ－GT、LDH、ACP活力分别下降46.0%、49.3%、50.8%（P＜0.05）。TFE及甲基睾酮组大鼠γ－GT活力相对于模型组提高33.9%、27.7%、35.7%；TFE、维生素E及甲基睾酮组ACP活力相对于模型组分别提高40.4%、19.6%、27.5%。见表2。

表1 TFE对腺嘌呤致衰老大鼠睾丸、附睾、精囊腺脏器指数的影响

表2 TFE对腺嘌呤致衰老大鼠睾丸中γ－GT、LDH及ACP的影响

表3 TFE对腺嘌呤致衰老大鼠睾丸中SOD、GSH－Px及MDA的影响

2.3 TFE对睾丸中SOD、GSH－Px及 MDA的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠睾丸中SOD、GSH－Px活力明显降低（P＜0.05），MDA含量显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，TFE组、维生素E组大鼠睾丸中SOD活性分别升高30.4%、37.6%；维生素E组大鼠睾丸中GSH－Px活性升高29.2%；TFE组、维生素E组大鼠睾丸中MDA含量分别降低20.2%、27.2%；甲基睾酮组大鼠睾丸中上述指标无明显变化（P＞0.05）。见表3。

2.4 TFE对血清睾酮的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠血清睾酮及LH显著下降。与模型组比较，TFE组、甲基睾酮组大鼠睾酮水平分别提高37.5%、43.0%，LH水平分别提高25.5%、30.6%；各组大鼠FSH水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 TFE对腺嘌呤致衰老雄性大鼠血清睾酮、FSH、LH的影响

3 讨 论

腺嘌呤通过间接和直接的方式造成睾丸功能的低下。它可导致大鼠慢性肾功能衰竭，继而通过下丘脑－垂体－睾丸轴的多个水平影响睾丸功能［5－6］。慢性肾功能衰竭影响LH脉冲式释放、提高血清催乳素水平，释放尿毒症毒素［7－10］。同时，腺嘌呤在体内代谢时由黄嘌呤氧化酶产生大量自由基，可直接影响合成睾酮的酶类（如17β羟基类固醇脱氢酶）的活性而致睾酮分泌减少［11］。除了上述内分泌因素外，睾丸功能还受到局部生化因素的影响。睾丸中的特异性生化酶类主要为LDH、ACP和γ－GT。LDH主要存在于睾丸生精细胞内，参与能量代谢，并与生精上皮成熟有关；ACP主要存在于睾丸Sertoli细胞中，参与蛋白质合成；γ－GT则可促进精子的成熟［12］。腺嘌呤造成大鼠类似人类由“肾阳虚”所致的睾丸病变，是制作实验动物模型的常用试剂。本实验中，TFE使腺嘌呤模型大鼠睾丸、精囊腺脏器指数相对模型组明显提高，标志性酶类γ－GT、LDH及ACP的活性增强，睾酮水平提高，且具有一定的抗氧化作用。与甲基睾酮相比，TFE在改善睾丸标志性生化酶类活力及抗氧化方面优于前者，但其对血清睾酮值的改善低于前者。与维生素E相比，TFE在改善睾丸标志性酶类活力、提高血清睾酮方面优于前者，但抗氧化作用弱于前者。从相关分析来看，推测LDH的活力可能主要受氧化应激的影响，而γ－GT可能与睾酮分泌相关，ACP则与二者都有一定的关系。因此，仅提高睾酮的含量或仅改善氧化应激似乎均不能对睾丸损伤起到较为全面的改善作用。TFE降低脂质过氧化代谢产物MDA的含量，且升高SOD的活性，这与以往实验报道结果一致［13－14］。TFE含多个黄酮类化合物，它们均具有酚羟基［15］，可能在代谢过程中通过自身的氧化而减轻组织的损伤，TFE的抗氧化作用有利于保护睾丸组织，但其特异性并不强。而睾酮对睾丸组织的曲细精管、生精细胞、Sertoli细胞的发育却是不可或缺的因素。因此，抗氧化与促进睾酮水平的提高是改善腺嘌呤所致睾丸病变中的两个重要因素，综合实验结果来看，TFE兼具抗氧化及提高睾酮水平的作用。淫羊藿在临床上用于肾阳不足、精气虚亏所致的性欲低下、阳萎以及因少精、精子活力低下所致的不育症［16］。上述实验结果表明TFE具有明显改善腺嘌呤致大鼠睾丸损伤的作用，其机制可能是促进性激素释放及抗氧化作用。

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