银翘解毒液1H-NMR指纹图谱研究

姜苗苗， 张 宇， 冯毅凡

（广东药学院中心实验室，广东 广州 510006）

中药指纹图谱是目前能够为国内外广泛接受的一种中药质量评价模式。1H-NMR作为一种波谱型指纹图谱与传统色谱型指纹图谱相比，在将复方中药体系中所有有效成分尽可能多的表现出来方面，具有全面性和整体性的优势［1-3］。由于1H-NMR中质子信号峰与样品中各个化合物的氢原子一一对应，因此1H-NMR指纹图谱是一种表达复方中药体系的合适的整体表征模式。此外，1H-NMR指纹图谱无须样品预处理，可避免色谱分离造成的成分损失，同时不会破坏样品的结构和性质［4］，适合于中药口服液类样品的快速检识。银翘解毒液作为常用清热解毒类非处方中药口服液，主要由金银花、连翘、桔梗、淡竹叶、牛蒡子、薄荷、荆芥、淡豆豉和甘草九味中药材组成［5］，目前尚无其指纹图谱研究的相关报道。本实验首次建立了银翘解毒液的1H-NMR指纹图谱，为其质量评价和质量控制提供一种全面、有效、快速可行的检测方法。

1 仪器与试药

BRUKER AVANCEⅢ500型超导核磁共振波谱仪，质子激发频率500.13 MHz，配置BBFO正相观察宽带探头和BVT3200数字控温仪。美国Wilmad WG-5000核磁样品管。D2O氘代度＞99.8%，美国Norell公司。实验用10批银翘解毒液(110101，110201，110203，110302，110305，110402，110502，110602，110605，110606)购自广东华南药业有限公司。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的配置

精密移取银翘解毒液样品450 μL，转移至5 mm核磁管中，并加入50 μL D2O，混合均匀后将核磁管加封直接用于1H-NMR测试。

2.2 1H-NMR测试条件

测定温度298 K；观测频率500.13 MHz；谱宽10330.58 Hz；90°脉冲宽度 14.50 μs；采样数据点65536；扫描次数32次；延迟时间6 s；混合时间0.1 s；接受增益128。

2.3 1H-NMR指纹图谱的测定

供试品溶液在500 MHz核磁共振仪上采用Topspin 2.0软件系统进行操控测试，以90%H2O+10%D2O锁场，使用预饱和脉冲序列NOESYGPPR1D在δ4.7处压制水峰，在2.2项的测试条件下测定1H-NMR图谱，得到一组FID信号。经过傅里叶变换、窗函数拟合、相位与基线校正，并用蔗糖端基质子信号定标后，得到1H-NMR指纹图谱。

2.4 图谱与分析数据的处理

应用MetresNova软件在δ 0～9.0范围进行分段积分，以0.04为最小间隔积分，得到224个数据点，即每段化学位移值下的相对峰面积积分值，并建立Excel数据库。根据相似度计算原理，利用Excel 2003软件进行相似度分析。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度实验 取同一份银翘解毒液供试品溶液，在上述1H-NMR测试条件下连续6次测定指纹图谱，用2.3项下的方法处理图谱，得到一系列相对峰面积积分值。计算6组数据之间的相关系数和夹角余弦值，结果均在0.99以上，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性实验 取同一批次银翘解毒液供试品溶液6份，测试1H-NMR指纹图谱，计算6组数据相对峰面积积分值之间的相关系数和夹角余弦值，结果均在0.99以上，表明该方法的重复性良好。

2.5.3 稳定性实验 取同一份银翘解毒液供试品溶液，分别在 0、4、8、12、16、20 h 测试1H-NMR 指纹图谱，计算6组数据相对峰面积积分值之间的相关系数和夹角余弦值，结果均在0.99以上，表明供试品溶液在常温实验条件下稳定性良好。

2.6 指纹图谱相似度分析

按2.1项下方法将10批银翘解毒液样品制备成供试品溶液，采用2.2、2.3和2.4项下方法测定和处理指纹图谱。10批样品的1H-NMR指纹图谱见图1。

图1 10批银翘解毒液1H-NMR指纹图谱Fig.1 1H-NMR fingerprint for ten batches of Yinqiao Jiedu Liquid

分别选择平均矢量和中位数矢量作为对照指纹图谱，计算10批样品的相关系数和夹角余弦值，结果10批银翘解毒液样品中有8批样品的相关系数和夹角余弦相似度在0.97以上，另外2批样品差异性较大，相似度在0.82～0.91之间。见表1。

表1 10批银翘解毒液相似度分析计算结果Tab.1 Evaluation of similarities on ten batches of Yinqiao Jiedu Liquid

3 讨论

3.1 水峰压制技术

在常规1H-NMR谱测试中口服液中的水峰质子信号非常强，常常掩盖了样品组分信号峰，因此有效的水峰抑制是测定口服液指纹图谱中的重要问题。我们分别采用预饱和单脉冲(1D sequence with f1 presaturation，ZGPR)、反相梯度预饱和单脉冲(1D sequence with presaturation using composite pulse and spoil gradient，ZGCPGPPR)、通过 T1作用增强的水峰抑制(WET solvent suppression with shape pulse，WET)和弛豫延迟和混合时间的预饱和梯度脉冲(with presaturation during relaxation delay and mixing time and spoil gradient，NOESYGPPR1D)4 种水峰抑制方法采集银翘解毒液的1H-NMR指纹图谱。所得的1H-NMR指纹图谱表明(图2)，4种方法对水峰抑制效率各不相同。其中NOESYGPPR1D抑制水峰效率最高，谱基线平整，改善了低浓度组分的信噪比和分辨率，因此本实验选择NOESYGPPR1D为1HNMR指纹图谱制谱过程中关键脉冲序列。

图2 4种脉冲序列下的银翘解毒液1H-NMR指纹图谱Fig.2 1H-NMR fingerprints of Yinqiao Jiedu Liquid acquired by four different pulse programs

3.2 指纹图谱特征分析与评价

银翘解毒液样品的1H-NMR信号峰分布在δ 0～9.0之间，主要分为三个特征区域:δ 0～3.0的饱和脂肪区、δ 3.0～5.5的糖基质子区以及δ 5.5～9.0的芳香区(图3)。低场区δ 5.5～9.0的芳香质子信号主要来自金银花中绿原酸等咖啡酰类有机酸和黄酮类成分［6］，连翘中苯乙醇苷和木脂素类成分［7］，淡竹叶中的黄酮［8］，牛蒡子中的木脂素［9］以及其他药材中大量带苯环的化合物。δ 3.0～5.5的质子信号主要来自口服液中的蔗糖和糖苷类化合物。高场区δ 0～3.0的饱和质子信号主要来源于连翘和桔梗中的三萜类成分［7，10］以及薄荷中薄荷醇等单萜类挥发油［11］等成分。根据上述分析，考察了药材阴性对照液与银翘解毒液的相关性(图4)，发现在银翘解毒液的1H-NMR指纹图谱中，芳香区和饱和脂肪区范围的质子信号表征了其的主要成分特征及相对比例，而中药制剂的化学成分及其比例差异性则反应了其质量的变化。

图3 银翘解毒液样品1H-NMR图谱的指纹分析Fig.3 Fingerprinting analyses for typical1H-NMR spectrum of Yinqiao Jiedu Liquid

图4 药材阴性对照液与银翘解毒液相关性考察Fig.4 Relationship between negative control solutions of herbs and Yinqiao Jiedu Liquid

本实验对10批银翘解毒液指纹图谱进行研究，其相关系数和夹角余弦值的相似度计算结果显示:不同批次样品指纹图谱主要峰群的整体面貌基本一致，但是在化学位移和相对积分面积值方面存在一定的差异，2批样品与其他8批样品的相似度相差较大，提示其质量的一致性和稳定性有所差异。另外，我们考察了市售银翘解毒液和同类产品银翘解毒合剂［12］的1H-NMR指纹图谱(图5)，尽管二者的药材成分相同，但其芳香区和饱和脂肪区质子信号具有明显差异，进一步说明该方法对样品测定的专属性有合理的鉴定。

本实验所建立的1H-NMR指纹图谱法稳定性高，精密度好，重现性佳，且分析速度快，同时全面表征了中药复方制剂中的多种复杂化学成分，化学位移对应的相对峰面积积分值也可以反应出化学成分之间的相对比例，因此本研究可以为市售银翘解毒液的质量评价以及质量标准的制定提供依据。

图5 银翘解毒液与银翘解毒合剂1H-NMR图谱Fig.5 1H-NMR spectra of Yinqiao Jiedu Liquid and Yinqiao Jiedu Mixture

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