朱砂安神丸定量指纹图谱可靠度研究

孙国祥， 尹 霞

（沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳 110016）

朱砂安神丸(ZSASW)来源于李东垣的《内外伤辨惑论》，每丸含0.9 g朱砂，1.35 g黄连，0.9 g地黄，0.9 g当归和0.45 g甘草，有清心养血，镇惊安神之功效，常用于心火上炎，热伤阴血所致的胸中烦热，心悸不宁，失眠多梦等［1］。文献有测定朱砂安神丸中硫化汞和小檗碱及指纹图谱研究［2-3］。本实验建立朱砂安神丸指纹谱并评价其可靠度，实现对化学指纹数量分布、含有量分布比例和整体含有量差异评价时具有的可靠度，成为中药指纹图谱鉴定中药质量的再评价方法。

1 对照指纹图谱可靠度评价［4-5］

由10批以上代表性样品指纹谱按均值法计算生成对照指纹图谱(RFP)必然产生不确定度。系统指纹定量法(SQFM)是根据宏定性相似度Sm(SF和S'F均值)和宏定量相似度Pm(P和C均值)及指纹变异系数α来整体监测样品化学指纹总体含量。中药对照指纹图谱是m批样品指纹平均模式(Sm=1，Pm=100%，α=0)，分别用 m 批样品 SF，S'F'，C，P标准偏差除即为不确定度见(1)式。把1扣除不确定度后得对照指纹谱宏定性可靠度SR见(2)式和宏定量可靠度PR见(3)式，二者越接近1表明对照指纹图谱越可靠。

2 单批指纹图谱可靠度评价［6-8］

单批指纹谱不确定度决定于指纹均化性变动系数α，见(4)式，依据 f，r，C，P得定性不确定度Ufj、比率定性不确定度Urj、投影含量不确定度UCj和等权含量不确定度UPj。把1扣除单批不确定度分别得到单批宏定性可靠度SRj见(5)式和单批宏定量可靠度PRj见(6)式，二者越接近1越可靠。SQFM和可靠度R划分标准见表1、表2。

表1 中药质量等级划分标准及其可靠度标准Tab.1 Division criteria for quality grade of traditional Chinese medicine

表2 中药质量等级的不确定度和可靠度的定性划分标准Tab.2 Qualitative division criteria of uncertaninty and reliability for quality grade of traditional Chinese medicine

3 实验部分

3.1 仪器和试剂 Agilent 1100型液相色谱仪(美国 Agilent)；小 檗 碱 (berberine，BBR，批 号20080717)、5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural，5-HMF，批号111626-200503)与阿魏酸(ferulic acid，FA，批号0773-9910)对照品，由中国药品生物制品检定所提供；甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯；12批市售朱砂安神丸，编号S1～S12，均购自沈阳各药店。

3.2 对照品溶液制备 精密称取小檗碱对照品12.5 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法配制500 μg/mL阿魏酸和1 mg/mL 5-羟甲基糠醛对照品溶液。

3.3 供试品溶液制备 取朱砂安神丸1丸，剪碎，精密称定，加甲醇50 mL，回流提取1 h，过滤，药渣加甲醇50 mL再回流1 h，合并滤液，减压浓缩至约16 mL，再用甲醇定容至25 mL，摇匀，作供试液。

3.4 色谱条件［3］Century SIL C18BDS柱 (200 mm ×4.6 mm，5 μm)；流动相 A 为 0.2%H3PO4溶液，B为0.1%H3PO4乙腈溶液。梯度程序:0～10 min，0% ～15%B；10～30 min，15% ～30%B；30 ～50 min，30% ～70%B；50 ～60min，70% ～85%B。体积流量1.0 mL/min，紫外检测波长265 nm，柱温(30 ±0.15)℃，进样量 5 μL，洗脱时间为 66 min。

4 结果与讨论

4.1 系统适用性试验 精密吸取各对照品溶液，以及供试品溶液各5 μL，分别进样，记录色谱图见图1。比较保留时间和在线紫外光谱确定8、24和34号峰分别为5-羟甲基糠醛、阿魏酸和小檗碱。选34号峰作参照物峰，测得理论板数应不小于11600。

图1 对照品和样品S1的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of references and S1 sample

4.2 方法学考察 以34号峰(小檗碱)保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间RSD均小于1.0%，精密度试验时各共有峰相对峰面积RSD均小于4.0%；稳定性试验时各共有峰相对峰面积RSD均小于4.0%；重复性试验时各共有峰相对峰面积的RSD均小于4.0%。结果表明方法精密度和重现性良好，在24 h内样品基本稳定。

4.3 指纹图谱建立和质量评价［10-11］测定12批朱砂安神丸指纹图谱见图2，确定55个共有峰，以12批样品谱按均值法生成准对照指纹谱并计算各样品Sm和 Pm，聚类分析得 S1～S6和 S9～S12为第Ⅰ类，S7和S8为第Ⅱ类。选取第Ⅰ类按均值法生成RFP见图2，重新评价12批样品见表3，结果 S1、S2、S3和S4质量极好，S6、S9、S10和S12质量很好，S5和S11质量好，而S7和S8质量劣。

图2 12批朱砂安神丸HPLC指纹谱Fig.2 HPLC fingerprints of twelve batches of Zhusha Anshen Pill

表3 12批朱砂安神丸质量评价结果Tab.3 Quality identifying results of twelve batches of Zhusha Anshen Pill

4.4 朱砂安神丸-HPLC-RFP可靠度［12-13］计算朱砂安神丸对照谱不确定度和可靠度为Uf=0.001，Ur=0.022，US=0.011，SR=0.989；UC=0.032，UP=0.026，UM=0.021，PR=0.979；其宏定性可靠度SR＞0.98表明RFP反映的化学成分数量和含有量分布比例的可靠性很高。其宏定量可靠度PR＞0.97，表明用RFP定量评价时具有很高可靠性。

4.5 12批朱砂安神丸-HPLC指纹谱可靠度［14-15］计算12批朱砂安神丸指纹谱不确定度见表4，结果S7和S8定性定量不确定度较高，其定性定量可靠度较低，说明此2个样品代表的指纹数量分布和含有量分布及整体含有量可靠度较低。其它10批朱砂安神丸定性定量可靠度均大于0.96，表明各批指纹谱反映的化学指纹数量和含有量分布比例及整体含有量的可靠度很高。

表4 12批样品不确定度和可靠度结果Tab.4 Results of uncertainity and reliability of twelve batches of sample

5 结论

对中药对照指纹图谱和单批指纹谱可靠度进行研究，对朱砂安神丸HPLC指纹谱可靠度评价，结果宏定性和宏定量可靠度均大于0.97，表明对照指纹谱具有准确可信特点。采用SQFM评价朱砂安神丸质量，对12批指纹谱所代表质量进行可靠度评价表明质量等级和可靠度无相关性。单批指纹谱可靠度仅是对鉴定结果可靠与否的评判，可靠度越大表明结果可信性越高。指纹谱定性定量不确定度是衡量指纹谱表达中药质量时所产生的不准确性尺度，指纹谱可靠度是衡量指纹图谱宏观定性定量鉴定中药质量结果可靠度的度量。本方法是中药指纹图谱评价中药质量的再评价。

［1］卫生部药典委员会.中华人民共和国药典:1990年版一部［S］.北京:人民卫生出版社，1990:430.

［2］成 波，刘春农.朱砂安神丸中硫化汞与盐酸小檗碱的含量测定［J］.山东医药工业，2003，22(1):12-13.

［3］尹 霞，孙国祥.朱砂安神丸高效液相色谱数字化指纹图谱研究［J］.中南药学，2011，9(2):135-140.

［4］Sun G X，Zhi X Z，Bi K S.Overall qualitative and overall quantitative assessment of compound liquoric tablets using HPLC fingerprints［J］.Anal Sic，2009，25(4):529-534.

［5］孙国祥，吴 波，毕开顺.平行五波长高效液相色谱指纹图谱全息整合法定量鉴定杞菊地黄丸的整体质量［J］.色谱，2010，28(9):877-884.

［6］胡 坪，罗国安，赵中振，等.人参中人参皂苷HPLC定量方法的测量不确定度的评定［J］.药学学报，2005，40(1):49-53.

［7］Sun G X，Liu J D.Qualitative and quantitative assessment of the HPLC fingerprints of Ginkgo biloba extract by the involution similarity method［J］.Anal Sic，2007，23(7):955-958.

［8］孙国祥，王玲娇，基于双波长HPLC指纹谱的一级系统指纹定量法鉴定木香顺气丸质量［J］.化学学报，2010，68(18):1903-1908.

［9］孙国祥，胡玥珊，毕开顺.系统指纹定量法评价牛黄解毒片质量［J］.药学学报，2009，44(4):401-405.

［10］孙国祥，侯志飞，毕雨萌，等.中药色谱指纹图谱潜信息特征判据研究［J］.药学学报，2006，41(9):857-862.

［11］孙国祥，任培培，毕雨萌，等.双定性双定量相似度法评价银杏达莫注射液的高效液相色谱指纹图谱［J］.色谱，2007，25(4):518-523.

［12］孙国祥，张静娴.基于三波长融合谱的系统指纹定量法鉴定龙胆泻肝丸的真实质量［J］.色谱，2009，27(3):318-322.

［13］胡 坪，罗国安，赵中振，等.中药材定量分析中测量不确定度的评定方法及其影响因素的研究［J］.药物分析杂志，2005，25(4):455-460.

［14］孙国祥，胡玥珊，张春玲，等.构建中药数字化指纹图谱研究［J］.药物分析杂志，2009，29(1):160-169.

［15］孙国祥，侯志飞，张春玲，等.色谱指纹图谱的定性相似度和定量相似度的比较研究［J］.药学学报，2007，42(1):75-80.