黄精多糖肽的单糖组成和抗氧化活性*

梁引库，吴三桥，徐仲阳，李新生，杨海涛，刘军海

1(陕西理工学院陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中，723000)2(陕西理工学院化学与环境科学学院，陕西汉中，723000)3(青海省农林科学院，青海西宁，810016)

黄精又名老虎姜、鸡头参、玉竹，始载于《名医别录》，属于百合科(Liliaceae)黄精属(Polygouatum)。有滇黄精(Polygonatum kingianum Coll.)、黄精(Polygonatum sibiricum Red.)或多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua.)的干燥根茎。黄精中主要成分是黄精多糖(Polygonatum sibiricum polysaccharides，PSP.)，黄精多糖能调脂，抑制动物动脉粥样硬化［1－2］，显著降低肾上腺素诱发的高血糖小鼠的血糖值［3］，延长果蝇的平均寿命和最高寿命［4］，能对抗环磷酰胺所致小鼠外周血白细胞的减少，具有抗贫血的作用［5］。此外，黄精多糖具有抗病毒及免疫激发作用，能提高小鼠的免疫能力［6－8］。黄芳等报道从菌体中提取的一般由葡聚糖组成的活性多糖具有一定的抗肿瘤活性［9］，例如从猪苓中提取菌体中提取的多糖组分其抗肿瘤成分是带(1－6)支链的 β-(1，3)-D-葡聚糖［10］;从香菇中提取的具有抗肿瘤活性的也是由β-1，3结合的直连葡聚糖构成。因此多糖的单糖组成对其活性具有重要的影响［11］。而黄精多糖肽又是黄精多糖的主要组成成分，多糖肽是多糖与蛋白质的复合体，研究表明多糖中多糖肽具有重要的药理学作用，而且肽类化合物与多糖等混合药理作用往往超过单纯的多糖和多肽［12，14］。而现今对黄精多糖肽的研究却鲜有报道。本研究以汉中黄精为研究对象，通过提取、分离和纯化等步骤分离纯化黄精多糖肽，并对黄精中的多糖肽的单糖组分和抗氧化活性进行系统的分析研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料

黄精，购于汉中药材市场，经陕西理工学院李新生教授鉴定为黄精块茎。黄精经洗净、烘干、粉碎并过40目筛备用。

1.1.2 试剂

鼠李糖、阿拉伯糖、D-木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，均为色谱纯;盐酸羟胺、吡啶、醋酸酐、蒽酮、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、甲醇、三氟乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、番红花红、乙二胺四乙酸二钠、浓硫酸、浓磷酸、硫酸钠、钼酸铵、三羟基甲烷、盐酸(37.5%)、邻苯三酚、VC、体积分数95%的乙醇、体积分数30%的H2O2等试剂，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV2550型紫外分光光度计(日本岛津科学仪器有限公司)，旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，JD-150E型超声波清洗机(宁波金达超声波仪器厂)，HH-S4型电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)，FA2204B型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，TDZ4-WS低速台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(武进电控仪器厂)，GC-MS ITQ900气相色谱质谱仪(美国热电)，OSO-T8260美国联合碳化透析袋MD25。

2 实验方法

2.1 多糖肽的提取

将干燥的黄精粉碎，称取150 g的黄精粉末，按料液比1∶10采用80℃水提法提取，过滤得提取液，重复提取3次，合并滤液并浓缩至1/5体积，然后加入乙醇使乙醇体积分数最终为80%，醇沉淀12 h，4 000 r/min离心10 min得沉淀，沉淀80℃烘干备用，即为多糖肽粗品。

2.2 多糖肽的纯化

用无离子水溶解粗多糖肽，加入 三氯乙酸使其最终浓度为3%，摇匀，冷藏过夜，而后4 000 r/min离心10 min，取上清液，除去游离蛋白质。然后用截留分子质量14 000 u的透析袋透析24h并浓缩至1/10体积，加乙醇使乙醇最终体积分数为80%，4℃醇沉12 h，4 000 r/min离心10 min，得到沉淀。取一定量的沉淀上DEAE-52纤维素柱，用无离子水洗脱多糖，直至用硫酸-蒽酮法测定无多糖洗出时，再用0.4 mol/L NaCl溶液洗脱3个柱体积，合并洗脱溶液，即为纯化的黄精多糖肽提取液。

2.3 硫酸-蒽酮法测糖含量

2.3.1 标准曲线的绘制

称取200 mg干燥至衡重的葡萄糖，定容至1 000 mL为储备液;取7支干净试管，分别移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2 mL 葡萄糖储备液，而后再分别加2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 和 0.8 mL 无离子水，硫酸蒽酮法测定葡萄糖含量［15］，以浓度为横坐标吸光度为纵坐标绘制标准曲线(图1)，得回归方程为y=4.84x+0.0749，R2=0.988 8，线性关系良好。

图1 葡萄糖标准曲线

2.3.2 多糖肽中糖含量测定

取3只干净试管，分别加入经2.1和2.2步骤纯化的黄精多糖肽2.0 mL和2 mL无离子水，同标准曲线法测定多糖肽的糖含量。

2.4 考马斯亮蓝G-250测蛋白质含量

2.4.1 标准曲线的绘制

准确称取10 mg牛血清蛋白配制0.1 mg/mL的原液。称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 90%乙醇中，加入0.85 g/mL的磷酸100 mL，最后用无离子水定容到1 000 mL。取6支干净的具塞试管，分别配制浓度为 0、20、40、60、80、100、120 μg/mL 蛋白溶，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量然后以以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线(图2)，得回归方程为y=5.433x+0.002 8，R20.987 4，线性关系良好。

图2 蛋白质标准曲线

2.4.2 蛋白质含量测定

取3只干净试管，分别加入经2.1和2.2步骤纯化的黄精多糖肽1.0 mL和1 mL无离子水，考马斯亮蓝法测定黄精多糖肽中蛋白质的含量。

2.5 GC-MS测定多糖肽单糖组成

2.5.1 多糖肽水解

取20 mL多糖肽溶液减压烘干，加入5 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，100℃下密封水解12 h，取出挥干。加少量的甲醇摇匀后挥干，重复此过程3次，之后80℃下干燥样品12 h。

2.5.2 单糖肽衍生化

称取多糖水解样品10 mg，加入10 mg盐酸羟胺和0.5 mL吡啶，放入90℃水浴加热反应30 min，并不时振荡。取出后冷却至室温，再加入0.5 mL醋酸酐，在90℃水浴中继续反应30 min，即为糖腈乙酸脂衍生物。

2.5.3 GC-MS分析条件

GC条件:分离柱:TG-SQC型，(30.0×0.25)mm毛细管柱，膜厚:0.25 μm;载气:氦气(99.99%);流量:1 mL/min;进样口温度:200℃;升温程序:160℃保留1 min，3℃/min升温至200℃保留2 min;分流比:7。MS条件:EI离子源:70eV;离子源温度:250℃;传输线温度:250℃;溶剂延迟:5 min;扫描质量范围:30～600 amu。

2.6 抗氧化活性的测定

2.6.1 羟自由基的清除

取0.15 mol/L pH 7.4的磷酸缓冲溶液1.0 mL，40 μg/mL 的番红花红 1.0 mL，0.945 mmol/L EDTAFe(II)(新鲜配置)1.0 mL，不同浓度的样品溶液0.5 mL，3%H2O221.0 mL(新鲜配置)，混合后在37℃水浴中反应30 min后在520 nm处测定吸光度As。空白组以0.5 mL无离子水代替样品测定吸光度Ao。对照组以1.5 mL无离子水代替H2O2和样品测定吸光度A，用3.5 mL无离子水代替番红花红、EDTA-Fe(II)、H2O2和样品，pH 7.4磷酸盐缓冲溶液调零。并按下式计算清除率［16］:

2.6.2 总抗氧化活性的测定(磷钼络合物法)

在10 mL比色管中，分别加入4 mL磷钼试剂液，0.4 mL样品，95℃水浴中恒温90 min，在695 nm波长下测定吸光度 A［17］。

2.6.3 超氧阴离子自由基清除作用

取pH值为8.2的Tris-HCl缓冲液9 mL于25℃恒温水浴20 min后，用微量注射器注入40 μL，于25℃预热过的邻苯三酚溶液立即倒入比色管中，于温度25℃下每隔30秒测定一次吸光度(420 nm自氧化速率控制在0.06·min－1左右)，邻苯三酚自氧化3 min后，加1滴0.08 mg/mL的Vc立即混匀，室温下放置5 min后测定其在420 nm下的吸光度即A0，可表示邻苯三酚的自氧化速率［18］。在上述Tris-HCl缓冲液中加入一定量的样品，再接上述方法测定邻苯三酚的自氧化速率得到A1，同时做一空白试剂A2，按下式计算:

3 结果与分析

3.1 黄精多糖肽的含量

经2.1和2.2步骤分离纯化的黄精多糖肽溶液经检测知，纯化黄精多糖肽中多糖浓度为0.081 mg/mL，蛋白质浓度为0.015 mg/mL，因此提取液黄精多糖肽浓度为0.096 mg/mL，黄精中多糖肽的含量为0.34%，黄精多糖肽中多糖与蛋白质比率为5.4∶1。

3.2 GC-MS测定的多糖肽单糖组成

GC-MS分析表明，鼠李糖、阿拉伯糖、D-木糖、甘聚糖、葡萄糖和半乳糖经过衍生化后GC-MS检测，其RT 分别为:6.02、6.31、6.55、11.12、11.42 和 12.00 min。GC-MS分析黄精多糖肽，黄精多糖肽的单糖组成分别为:鼠李糖、阿拉伯糖、D-木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其相对百分含量分别为:2.12%、1.81%、2.51%、65.4%、14.3%、13.8%。黄精多糖肽中的单糖主要是甘露糖，甘露糖含量最高，可达65.4%;而阿拉伯糖含量最低，为1.81%。

图3 标准单糖和样品的GC-MS图

3.3 抗氧化活性测定结果

3.3.1 对羟基自由基的清除作用——Fenton氧化法

图4表明，随着黄精多糖肽和Vc浓度的增高，黄精多糖肽和Vc对羟基自由基的清除率也逐渐增高，当其浓度达到0.12 mg/mL时，黄精多糖肽和Vc对羟基自由基的清除率也达到最高，此时黄精多糖肽和Vc对羟基自由基的清除率分别为56.76%和35.7%。在相同浓度下黄精多糖肽对羟基自由基的清除率高于Vc的清除率，尤其是在高浓度条件下其对羟基自由基的清除率显著高于Vc对羟基自由基的清除率。

图4 黄精多糖肽对羟基自由基的清除

3.3.2 总抗氧化活性—磷钼络合物法

图5表明，黄精多糖肽总抗氧化活性随着浓度的增加而增加，当黄精多糖肽的浓度达到0.12 mg/mL时其总抗氧化活性最高，黄精多糖肽具有较好的抗氧化活性。而在相同浓度下黄精多糖肽的总抗氧化活性低于Vc的总抗氧化活性。

图5 黄精多糖肽和Vc的总抗氧化活性

3.3.3 超氧阴离子自由基清楚作用(邻苯三酚自氧化法)

本实验采用邻苯三酚自氧化法测试了黄精多糖肽和Vc对邻苯三酚自氧化过程中产生的超氧阴离子的清除作用。图6表明，黄精多糖肽和Vc对超氧阴离子的清除能力随着浓度的升高而增加，当黄精多糖肽和Vc的浓度达到0.12 mg/mL时其对超氧阴离子的抑制率达到最大，分别为51.2%和42.8%。由此可见，黄精多糖肽对超氧阴离子自由基具有较强的抑制效果。相同浓度下与Vc相比，黄精多糖肽对超氧阴离子的清除率显著高于Vc的清除率。

图6 黄精多糖肽对超氧阴离子的抑制率

4 结论

在本研究中，分别对标准单糖进行了衍生化处理，确定了单糖的RT，但在GC-MS分析过程中发现，单糖衍生化处理过程中出现了多种杂峰，经GC-MS自带数据库分析表明这些杂峰是单糖衍生化过程中生成的其它糖腈乙酸脂衍生物，属于附带反应。单糖衍生化分析表明，反应过程中产生的杂峰不影响各种单糖衍生化产生的特征峰，而且分析发现各种特征峰随着其浓度的增大而增大，特征峰与单糖具有较好的量效关系，因此单糖衍生化产生的这种特征峰可以表征单糖。多糖肽水解及衍生化分析发现，衍生化处理后，GC-MS图谱同样出现与标准单糖衍生化产生的相同杂峰，扣除后杂峰后表明黄精多糖肽的单糖组成主要是鼠李糖、阿拉伯糖、D-木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等，其相对百分含量分别为:2.12%、1.81%、2.51%、65.4%、14.3%、13.8%。分别检测黄精多糖肽中的蛋白质和多糖发现，黄精中多糖肽的含量为0.34% ，其中多糖与蛋白质的比率为5.4∶1;黄精多糖肽的抗氧化活性表明，黄精多糖肽具有较好的抗氧化活性，对超氧阴离子和羟基自由基具有明显的抑制作用，在总抗氧化能力实验中表现出较强的活性，并且呈明显的量效关系;不过黄精多糖肽的对羟基自由基及超氧阴离子的清除高于Vc，总抗氧化活性则显著低于Vc。这说明黄精多糖肽可能具有抗炎、抗衰老等方面的活性。

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