纤维水解液发酵生产琥珀酸研究进展

吴琼，谢慧，王风芹，任天宝，宋安东

(河南农业大学生命科学学院，河南郑州，450002)

琥珀酸，学名丁二酸，是一种常见的天然有机酸，除了存在于琥珀中外，还存在于人体、动物、植物和微生物中。琥珀酸是TCA循环的中间产物之一，在生物代谢中占有非常重要的位置。作为一种重要的碳四平台化合物，琥珀酸是多种重要的中间产物和专业的化学制品，广泛应用于食品、医药、农药、染料、香料、油漆、塑料等行业。在2004年美国能源部公布的12种最有潜力的大宗产品中，琥珀酸排第一位［1］。琥珀酸也是公认为继柠檬酸和乳酸后的下一个大规模生产的有机酸产品［2］。估计全球琥珀酸的总产销量为1～2万t，而全世界琥珀酸及其衍生物的市场潜在容量每年在27万t左右。

传统的琥珀酸生产方法是依赖以石油为主的化石能源为原料来化学合成琥珀酸。目前，国际市场上琥珀酸的年需求量已超过15 000 t，年增长速率平均为6%～10%，售价为14 000～16 000元/t，它们大部分是通过石化法生产得到的。然而，随着全球能源危机的不断加剧，导致石化法生产琥珀酸的成本逐年攀高，从而抑制了琥珀酸的发展潜力。新兴的发酵法生产琥珀酸以其低的能耗、高环保性和原料的可持续利用性而受到越来越多科学家们的重视。日本三井物产株式会社首创以玉米淀粉为起始原料发酵生产琥珀酸的工艺，其年产在5 000 t左右。美国应用碳化学公司早在2002年就采用微生物发酵法来生产琥珀酸，目前年产量为5 000 t。欧洲最大的淀粉及其衍生物生产商Roquette公司也在2009年将琥珀酸推向了商业化。

木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，据估计木质纤维质原料占世界生物质量(100亿～500亿t)的50%。我国是一个有着丰富植物纤维资源(如农作物秸秆、林产品加工业下脚料等)的国家，每年仅玉米秸秆一项就超过1.7亿t［3］。中国每年浪费或低利用的纤维材料总共约10亿t，其中农作物秸秆一项约7亿t，其主要成分为纤维素和半纤维素，它们都可通过水解的方法降解成相应的低分子糖，进而利用微生物发酵来大规模的转化制备琥珀酸等生物基化工产品，产业前景相当广阔［4］。若能以农作物秸秆水解液为主要原料产业化生产琥珀酸，将会有效减少现今琥珀酸发酵对淀粉原料的依赖性，并且降低了原料成本［5］。这不仅摆脱了对化石能源的依赖，而且开辟了温室气体CO2利用的新途径，使琥珀酸成为未来最重要的生物基化工产品之一［6］。

1 纤维水解液发酵生产琥珀酸工艺流程和目前水平

发酵法生产琥珀酸的研究始于20世纪80年代，美国能源部在20世纪90年代初联合Argonne National Laboratory等4个国家级实验室以及应用碳化学公司，投资700万美元来进行琥珀酸的发酵与提取计划的研究(W－31－109－Eng－38)［7］。国内在这方面的研究还处于起步阶段。苏溧［8］等以葡萄糖为原料，在血清瓶中发酵24 h琥珀酸产量达8.3 g/L，在5 L发酵罐中培养、葡萄糖质量浓度分别为10 g/L和100 g/L时，琥珀酸的产量分别达到8.2 g/L和45.6 g/L。目前国内外所报道的利用发酵法生产琥珀酸的最高产量为 110 g/L［9］。

纤维水解液发酵生产琥珀酸的过程首先是将纤维质原料(如玉米秸秆、玉米籽皮、玉米芯等)利用物理或化学的预处理方法破坏纤维质原料的内部结构;再加入水解酶或能产生水解酶的微生物使纤维质原料充分转化为低分子糖类如葡萄糖和木糖等，最后通过微生物的发酵过程来生产琥珀酸。其工艺流程如图1。Kim［10］等利用木材水解液作为产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)的碳源，发酵生产琥珀酸，产量为11.73 g/L。Lee［11］等利用木质水解液生产琥珀酸的最终产量达24 g/L。姚嘉旻［12］等通过稀酸水解玉米芯制备琥珀酸，产量最高可达35.2 g/L。目前，对纤维水解液发酵生产琥珀酸的研究主要集中在工程菌株的定向选育、发酵微生物的代谢工艺优化和纤维水解液脱毒工艺方面。李兴江［13］等通过软X射线诱变和代谢调控发酵菌株，最终利用秸秆水解液为原料使五、六碳糖共代谢产琥珀酸量达68.7 g/L。吴昊［14］等通过对玉米籽皮稀酸水解液脱毒处理后所产琥珀酸量达到43.2 g/L。

图1 纤维水解液生产琥珀酸工艺流程图

2 纤维水解液发酵生产琥珀酸相关微生物

菌种在发酵法生产琥珀酸的过程中占有重要的地位。琥珀酸是一些厌氧和兼性厌氧微生物代谢途径中的共同中间物［7］。大多数琥珀酸产生菌都是从反刍动物的瘤胃中分离得到，如丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌及瘤胃细菌都能够分泌琥珀酸。目前的研究集中在产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、大肠杆菌(E.coli)和产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens)这3类菌上，前二者为兼性厌氧菌，发酵过程需要经过好氧和厌氧两个阶段，在好氧阶段需消耗底物以获得较高的细胞密度，在厌氧阶段才能达到高产琥珀酸;后者为专性厌氧菌，且不耐高浓度的底物，故限制了其工业生产前景，在最优条件下(pH 6.2，高浓度CO2)，以葡萄糖为原料，其琥珀酸产量可达到35 g/L。近几年也有通过构建工程菌株使大肠杆菌在完全好氧的条件下来发酵生产琥珀酸的报道。表1列出了一些在发酵应用中报道较多且产量较高的琥珀酸产生菌发酵方式和琥珀酸产量状况的比较。

利用纤维水解液为原料产琥珀酸的微生物目前以产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)为主。产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)是从动物的瘤胃中分离得到的一种革兰氏阴性菌，经16s rRNA鉴定为巴斯德菌科放线杆菌属。葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、木糖等都是这类微生物可以利用的碳源，并能够耐受高浓度的琥珀酸盐。以葡萄糖为底物时，发酵产物中主要有琥珀酸、乙酸以及少量的甲酸和乙醇。CO2的固定和利用对该菌种的琥珀酸产量有较大的影响，同时该菌种还能够利用外源氢气作为电子供体，并以富马酸作为电子受体，以葡萄糖做底物在一般条件下琥珀酸的最终发酵产量可达50 g/L，而当使用100%氢气时，琥珀酸产量最高可达110 g/L［9］。李兴江［15］等通过对琥珀酸放线杆菌产琥珀酸代谢工艺的优化，得到以农作物秸秆为原料发酵琥珀酸产量最高达73 g/L。虽然目前对该菌种的研究还较少，但该菌已是迄今为止报道耐高糖和高盐的菌种，并已初步具备工业化生产的能力［16］。此外，产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens)有报道称也可以利用纤维水解液，琥珀酸产量可达 24 g/L［17］。Lee［18－20］等连续研究发现，曼海姆产琥珀酸菌(Mannheimia succiniciproducens)利用木质纤维素水解液为碳源连续发酵生产琥珀酸得率为55%，生产能力3.19 g/(L·h)，在连续发酵条件下的生产能力也是目前报道的最高值，显示了良好的应用前景。由于传统菌株产琥珀酸能力还不强，近年来也有学者研究利用基因工程手段获取高产琥珀酸的重组大肠杆菌。邢建民［21］等利用重组大肠杆菌ptsG突变株以玉米秸秆水解液为原料生产琥珀酸，产量达57.81 g/L。

表1 几种主要的琥珀酸高产菌株发酵方式和产量状况的比较

3 琥珀酸发酵生产代谢途径和菌种选育

菌种的代谢途径对琥珀酸的产量有着至关重要的影响。发酵法制备琥珀酸的过程是将EMP途径中得到的PEP经由TCA循环的还原支路，通过一步CO2固定和两步还原反应生成琥珀酸，该过程涉及的关键酶有磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、苹果酸脱氢酶、富马酸酶和富马酸还原酶［25］。图2是产琥珀酸放线杆菌和产琥珀酸厌氧螺菌的代谢途径。在厌氧条件下微生物通过PEP羧化激酶和PEP羧化酶途径固定CO2产生琥珀酸;在好氧条件下也可通过异柠檬酸酶产生少量的琥珀酸［2］。磷酸烯醇式丙酮酸、草酰乙酸、苹果酸、富马酸是产琥珀酸放线杆菌产琥珀酸代谢途径中的4种关键代谢副产物。而大肠杆菌产琥珀酸的代谢途径较为复杂，且只能通过TCA循环中的还原支路生成琥珀酸，故琥珀酸的产量较低。图3是大肠杆菌的琥珀酸代谢途径。构建产琥珀酸的重组大肠杆菌已成为目前琥珀酸发酵生产中的研究热点。Vemuri［24］等将编码丙酮酸羧化酶基因的质粒转移到大肠杆菌AFP111(AFP111/pTrc99A-pyc)中，通过好氧与厌氧两步发酵76 h，以葡萄糖为底物发酵产琥珀酸量可达99.2 g/L，见表1。这也是产琥珀酸大肠杆菌研究中一个突破性的进展，在目前众多工程菌株中，该菌株也是发酵法制备琥珀酸最具工业价值的。Lee［26］等通过基因敲除获得了不形成副产物的代谢工程菌，以葡萄糖为底物发酵产琥珀酸水平达到52.4 g/L，比野生菌有了大幅度的提高。于丽［27］等还研究了重组大肠杆菌 JM001(△ppc)/pTrc99a-pck以葡萄糖为底物发酵产琥珀酸的性能，结果表明厌氧条件下产酸能力为对照菌株JM001的15.3倍。此外，Guettler等人［9］以产琥珀酸放线杆菌130Z(Actinobacillus succinogenes)为出发菌株，筛选出抗单氟乙酸的自发突变株FZ53。以葡萄糖为底物，发酵84h后可产琥珀酸量达66.4 g/L，而在最适条件下，此菌株的琥珀酸产量可以达到80～110 g/L，发酵时间48h，得率高达97%，而且乙酸等副产物极少，并能耐一定浓度的盐溶液，具备了初步工业化生产的能力。McKinlay［28］等还通过 NMR和 GC-MC分析13C原子标记的代谢中间产物，对产琥珀酸放线杆菌130Z的代谢途径和代谢流进行了修正，最终证明了在高CO2和H2浓度下产琥珀酸放线杆菌的琥珀酸产量的增加和甲酸、乙酸和乙醇副产物的减少。国内研究中，李兴江［13］等通过软X射线诱变选育乙酸及乳酸代谢阻断突变株，降低了乳酸和乙酸的代谢流量。同时，通过添加少量的柠檬酸盐可间接促使琥珀酸代谢流量的增加，最终使得以纤维水解液为原料发酵生产琥珀酸量达到68.7 g/L。黄秀梅［25］等通过外源添加一些代谢中间体提高了产琥珀酸放线杆菌HMP和EMP代谢途径的通量比，解决了琥珀酸合成过程中还原力不足的矛盾。此外，一些金属离子和维生素也会对琥珀酸放线杆菌产琥珀酸的代谢途径产生影响。李兴江［15］等通过研究一些金属离子和维生素的添加浓度，最终得到利用纤维水解液为原料发酵生产琥珀酸量为58 g/L。

图2 产琥珀酸放线杆菌和产琥珀酸厌氧螺菌的代谢途径

图3 大肠杆菌的琥珀酸代谢途径

4 纤维水解液生产琥珀酸发酵条件优化

4.1 CO2对琥珀酸发酵的影响

琥珀酸发酵过程是典型的厌氧发酵。无论是以葡萄糖为原料还是以纤维水解液为原料发酵生产琥珀酸，CO2和H2对琥珀酸的代谢有着重要的作用，直接影响琥珀酸的产生［29］。增大CO2浓度和(或)H2的浓度，可提高琥珀酸的产量。研究表明，产琥珀酸放线杆菌130Z的培养基中CO2水平低时，琥珀酸产量会减少。因此，当前研究者大多采用在发酵罐中持续不断地通入CO2的发酵工艺，以保证琥珀酸产生菌对CO2的固定，这也是琥珀酸发酵工艺中与其他有机酸发酵所不同的地方［30］。发酵过程中外源供给CO2的形式可以是碳酸盐也可以是CO2气体。在培养基中添加碳酸盐可以与发酵过程中产生的有机酸反应，释放出CO2用于合成琥珀酸，同时还可调节发酵液的pH值;以CO2气体作为CO2供体时，则还需流加碱液以中和发酵过程所产生的琥珀酸等有机酸。陈可泉［31］等在对 Actinobacillus succinogenes NJ113 的研究表明，以CO2气体作为CO2供体，底物为葡萄糖时菌体生长、CO2固定效率、琥珀酸产率以及琥珀酸得率均优于碳酸盐。李兴江［32］等通过单因素试验和神经网络分析得出以秸秆水解液为原料发酵琥珀酸的最佳条件为:CO2体积含量62%、H2体积含量5.4%及生物素微量浓度为7.8 mmol/L时，产酸最高为75.8 g/L。PEP羧化激酶是产琥珀酸放线杆菌厌氧合成琥珀酸代谢途径中的关键酶［33］。它参与了对CO2的固定并直接影响着后续代谢环节的进行和琥珀酸的产量。理论上每生成1 mol琥珀酸需要消耗1 mol CO2。如果将发酵生产琥珀酸与其它能产生CO2的生产过程(如发酵生产乙醇)进行耦合，不仅可将释放的CO2加以利用，实现多种产物联产，而且还可减少温室气体的排放。在微生物固定CO2产生琥珀酸的反应过程中，培养基中的碳酸盐含量、发酵液的pH值、温度、搅拌转速及等均可影响到CO2的固定过程［31，34］。因此，通过优化和控制发酵培养的条件，可以增强CO2的固定效果，从而提高琥珀酸的产量。Guttler［35］等通过考察得出了Actinobacillus succinogenes 130Z的最适生长和产酸pH值为6.8。同时，固体碳酸盐也是调节pH值的理想物质。陈可泉［31］等在5 L发酵罐中对Actinobacillus succinogenes NJ113进行培养条件的优化，得到结果表明，以CO2气体作为CO2供体，葡萄糖为原料，通气量为0.75 L/min，搅拌转速为200 r/min，培养温度为37℃，pH值是6.6时为最佳条件，其最终CO2固定速率达到0.6 g/(L·h)，琥珀酸产率达到 1.61 g/(L·h)。Mark［34］等还研究了重组大肠杆菌AFP111以葡萄糖为底物时固定CO2的最适pH值为6.4，此外，作者还研究得出NO2、O2、CO和SO2这些气体的少量存在并不会引起琥珀酸产量的减少。利用基因工程手段也可对CO2的固定过程进行改造，通过增强琥珀酸代谢途径中关键酶的表达和敲除或失活琥珀酸竞争途径中的酶基因来提高琥珀酸的产量。Kim［36］等利用基因重组技术，将琥珀酸放线杆菌中丙酮酸羧化酶基因pck在已敲除ppc基因的突变菌株大肠杆菌K.12 ppc中过量表达，结果表明过量表达丙酮酸羧化酶最终使琥珀酸的产量提高了6.5倍［37］。

4.2 培养基对琥珀酸发酵的影响

不同碳源的培养基对提高琥珀酸产量影响不大，主要是控制接种量和加入适量的 Na+和 Mg2+［38］。目前，培养基优化方面的研究主要以葡萄糖为底物进行优化。而以纤维水解液为原料进行的发酵培养基优化研究还非常欠缺。郑璞［39］等对琥珀酸放线杆菌的发酵培养基进行优化后，得到以葡萄糖为原料产琥珀酸的量为41.69 g/L。此外，加入一定量的碳酸钠可提高大肠杆菌AFP18的产酸率［40］。

4.3 发酵方式对琥珀酸发酵的影响

发酵方式对于在工业化生产中提高琥珀酸的产量有着重要的影响。目前以纤维水解液为原料发酵产琥珀酸的发酵方式多为分批式发酵，而补料发酵还研究较少。郑璞［41］等以秸秆水解液作为原料，对比了分批与补料两种方式发酵生产琥珀酸，其产量分别为45.5 g/L和53.2 g/L。董晋军［42］等还利用菊芋原料以同步糖化补料分批发酵的方式生产琥珀酸，最终产量达98.2 g/L，发酵效果明显优于糖化后发酵。

5 纤维水解液发酵生产琥珀酸脱毒工艺

纤维水解液作为琥珀酸产生菌的发酵原料，是经过物理或化学的预处理方法处理后所得到的。这个过程会发生一系列反应，产生大量的色素和有机酸、糠醛、多酚类等化合物，水解液呈黑褐色，这些物质都属于发酵抑制物，影响细胞的生长与代谢，必须加以脱除。目前，报道最多且最常用的方法是活性炭脱毒。姜岷［43］等研究了稀酸水解玉米皮制备琥珀酸发酵糖液的工艺条件，其水解液经活性炭脱色后，在厌氧条件下发酵表明玉米皮水解液可替代葡萄糖作为琥珀酸发酵的碳源。吴昊［14］等利用活性炭脱毒后的玉米籽皮水解液发酵产琥珀酸，得到的琥珀酸产量达42.3 g/L。同时，水解液的脱色率为92.27%，糠醛脱除率75%，5-羟甲基糠醛脱除率53%，多酚类化合物脱除率98%，总糖损失低于5%。此外，黄秀梅［5］等利用活性炭和Ca(OH)2同时使用去除玉米秸秆水解液中的发酵抑制物，使琥珀酸的产量达到66.23 g/L，抑制物糠醛及羟甲基糠醛(HMF)的去除率分别为91.11%、89.83%，而总糖损失率仅为5.57%。

6 面临问题及展望

琥珀酸作为一种优秀的化学平台产品，用途广泛。通过生物转化法，经过合理的过程优化，具有巨大的发展潜力。利用纤维水解液发酵生产琥珀酸不仅绿色环保，而且可以缓解当前所面临的粮食危机和温室气体CO2引起的温室效应。目前，发酵法大量生产琥珀酸还面临着很多潜在的问题，具体主要有以下几个方面:

(1)以纤维水解液为原料的发酵条件优化方面还有待研究，尤其是发酵培养基条件的优化。目前，以纤维水解液为原料发酵琥珀酸的研究主要集中在菌种代谢调控方面，发酵条件的优化方面还研究很少。由于纤维水解液中成分复杂且含有多种有毒物质，抑制琥珀酸产生菌的生长和代谢。因此，获得一种以纤维水解液为原料的最佳发酵培养基条件对琥珀酸的产量有着重要的影响。

(2)发酵过程难以达到厌氧环境，甚至发酵用水也须经过脱气处理，这在工业化生产中较难实现。若解决了控制厌氧条件难的问题，将会大幅降低发酵产琥珀酸的成本。

(3)琥珀酸高产菌株的选育还不足。筛选或构建一株能用于工业化生产的高产菌株是今后研究的热点。目前对大肠杆菌的基础研究较透彻，其生长代谢速度快，是最有潜力的改造菌株，但产酸能力差，发酵困难，基因工程构建菌株耗资多，菌株易退化，工业生产还有一定难度［1］。发酵同时产生大量杂酸也是亟待解决的问题。利用基因工程技术改造大肠杆菌基因来达到高产琥珀酸将在未来受到重视。

随着能源危机和粮食安全问题的日益严重，利用纤维质原料来生产琥珀酸在经济性、环境性、社会性等方面都具有巨大的优势。尽管目前全世界琥珀酸的市场需求量还不是很高，但一直处于快速增长状态。据2006年韩国Song［44］等报道丁二酸酯及聚酯的潜在市场将达到每年2 700万t。很多国家和科研院所都对纤维水解液生产琥珀酸的产业化生产进行了评估和探索，相信利用纤维水解液发酵生产琥珀酸的产业化会在未来取得显著的发展。

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