大米活性肽功能效应研究方法及其应用前景*

方婧杰，梁盈，2，林亲录，吴跃，吴伟，高宇

1(中南林业科技大学稻谷及副产物深加工国家工程实验室，湖南长沙，410004)2(华南理工大学淀粉与植物蛋白深加工教育部工程研究中心，广东广州，510630)

大米作为人类主要粮食作物之一，其生产与深加工一直受到食品科学家们的高度关注。联合国粮农组织统计数据显示，2009/2010年度世界大米产量为456百万t。这些大米除供应人们日常饮食需要之外，尚有很大比例的大米用作工业发酵和淀粉糖生产原料。而在淀粉糖、味精和有机酸等生产过程中所产生的副产物米渣，其蛋白质含量可高达40%～65%;另一大米加工的副产品米糠，是糙米碾白过程中被碾下的皮层及少量米胚和碎米的混合物，经脱脂后米糠中蛋白质含量可达12%～18%左右［1］。因此，如何大力开发这一丰富的大米蛋白资源，成为近年来国内外的研究热点。

在我国，由于受技术条件的影响，大米资源深度开发利用仍处起步阶段，研究水平落后于发达国家。其蛋白质含量丰富的副产品大部分被用于饲料工业或自然排放，不仅浪费资源，也造成环境污染。而活性肽概念的提出以及分离检测技术的提高，使人们开始重视对这些大米副产品资源的深加工利用。各种生物、化学方法也逐渐应用到大米活性肽功能效应的研究当中。目前已经获得了多种大米生物活性肽，并已投入生产应用，如抗氧化活性肽、降血压活性肽、阿片活性肽等。当前，对大米活性肽继续展开更为深入的研究成为学术界的重要任务。同时，将其更为广泛的应用到食品工业当中，亦具有重要的现实意义。不仅为大米蛋白资源开发利用开辟了一条重要途径，也为活性肽成为功能性食品添加剂和多肽类药物的研究打开了新局面。

1 大米活性肽的功能效应

1.1 大米抗氧化活性肽

对于大米抗氧化活性肽的研究，一般只是通过酶解制得具有抗氧化活性的大米混合肽。贾俊强［2］等采用超声波预处理大米蛋白，再利用中性蛋白酶酶解制备出大米抗氧化混合肽，其清除DPPH的能力可达到74.8%，大米蛋白经胃蛋白酶处理，所得酶解物对化学体系产生的O2－、OH-及DPPH自由基有很强的清除能力，还能有效抑制小鼠肝匀浆丙二醛(MDA)生成及红细胞氧化溶血程度，尤其对亚铁离子诱导的小鼠肝脏匀浆液的抑制作用最明显，抑制能力与维生素E相当;申衍豪［3］使用碱性蛋白酶酶解大米蛋白同时给予超声处理得到大米活性肽，并通过离子交换层析、凝胶色谱和RP-HPLC进行混合肽的分离测定，得到的F3b组分清除DPPH自由基的能力最强，可达89.53%;张强［4］等以脱脂米糠蛋白为原材料，经过胰蛋白酶水解制得米糠肽(肽及氨基酸的混合物)，经测定得出米糠肽具有较强的还原力，对脂质过氧化和油脂过氧化均具有良好的抑制作用，并能抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血反应和肝组织匀浆脂质过氧化反应的发生。

1.2 大米降血压活性肽

蒋艳［5］等采用不同的蛋白酶对碎米蛋白进行水解，得出最佳水解酶为风味蛋白酶，同时确定出的最佳酶解工艺条件下ACE抑制肽的抑制率可达85.4%。Yoshiyukis［6］等以大米制黄酒后得到的副产物酒糟为原料，经蛋白酶处理，分离获得了9种有血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制活性的肽，其中的Arg-Tyr与Ile-Tyr-Pro-Arg-Tyr以100 mg/kg剂量饲喂患原发性高血压的老鼠30 h后仍有降压效果;刘志国［7］等分别用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶单独或联合水解米糠蛋白，酶解组分中含有较高ACE抑制活性成分，其相对分子量在500 u以内，其中活性组分主要为Arg-Tyr、Met-Trp、Gly-Val-Tyr或 Gly-Asp-Phe，这些组分共同特征是C端具有苯环样结构。

1.3 大米免疫活性肽

大米生物活性肽是被中国卫生部批准的具有调节免疫力的功能食品。从大米胰蛋白酶解物中获得的免疫活性肽，具有促进平滑肌收缩的作用，还可以诱导体外人血白细胞的吞噬活性，并且能刺激白细胞中超氧阴离子的产生［8］;还有报道显示被命名为Oryzatensin的肽分子氨基酸序列为Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Arg，Oryzatensin亦为一种免疫活性肽肽，浓度为1 μmoL/L时，吞噬作用明显，吞噬指数为控制值的1.5倍。并且能抑制肿瘤细胞的生长，同时其还具有引起豚鼠回肠收缩，抗吗啡和免疫调节的活性，主要是通过激活磷脂酶水解溶血磷脂酸释放花生四烯酸来引起收缩的［9］。

1.4 阿片活性肽

陈季旺［10］等采用氨基酸分析仪、LC-MS对米糠类阿片拮抗肽的结构进行分析，得出其氨基酸序列为Asp-Gly-Ser-Val-Arg;而用胰蛋白酶处理大米蛋白，得到具有阿片活性的肽，其结构为Try-Pro-Met-Try-Pro-Leu-Pro-Arg［11］。

1.5 类阿片拮抗肽

除大米清蛋白酶解产物oryzatensin具有阿片拮抗活性外，陈季旺［12］等采用超滤法从米糠可溶性蛋白酶解物中初步分离提取出一种能拮抗吗啡成瘾性的类阿片拮抗肽，其分子量为530 u氨基酸系列为Asp-Ser-Val-Arg，并通过超滤法提取后发现类阿片拮抗肽活性明显增强;有研究［13］表明用蛋白酶处理低温脱脂米糠后，其水解产物具有明显的类阿片拮抗活性，结构分析确定该成分的氨基酸序列为Asp-Gly-Ser-Val-Arg，相对分子质量为546 u。

1.6 大米风味肽

现代仪器分析表明，酶解大米蛋白可以分离出具有代替谷氨酸钠(MSG)的风味肽，呈现鲜味。如果将这类肽与矿物质微量元素螯合起来，还可减少矿物质元素之间的竞争。米蛋白及米糠蛋白中含有丰富的谷氨酰胺和天门冬酰胺，通过Alcalase蛋白酶水解作用和脱酰胺作用，使7.6%的肽键水解，生产风味肽，可用以取代可能对人体有害的味精类风味增强剂［14］;一些蛋白饲料(如菜籽粕、棉籽粕)适口性差，在饲料中添加谷氨酸多肽可有效掩盖苦味增强饲料的黏度、改善饲料的适口性，将其应用于畜牧业上能显著提高动物的采食率，而且来源安全可靠，无毒害作用。

目前，虽然已经发现大米活性肽具有上述生理活性特征，但对其实际应用开发仍处于摸索阶段，对大米活性肽功能效应的研究开发也以实验室阶段为主，尚未形成大规模的工业化生产，同时从研究内容可看出，实验室开发研究亦存在很多问题，如:①对抗氧化活性肽、ACE抑制活性肽研究较集中，而对免疫活性肽、阿片活性肽以及类阿片拮抗肽等研究较少;②对活性肽作用机制的研究较少，特别是在分子水平上的研究更是少有报道;③稻米蛋白序列中是否还存在着其它活性肽，如高F值肽、降脂肽、降胆固醇肽、促生长肽等鲜见报导;④就已确定几种大米蛋白活性肽看，主要是胰蛋白酶和碱性蛋白酶作用产物，其它类型酶水解产物中肽功能和结构鉴定工作还需深入，以产生和确认更多大米活性肽。因此，要让大米活性肽真正服务于人类营养和健康，还有许多科学和技术上的问题需要解决。

2 大米活性肽的研究方法及进展

2.1 大米活性肽分离与鉴定的研究方法

由于技术操作、经济成本等方面的限制，利用酶解大米蛋白质制备生物活性肽成为当前最为安全可行的方法。即主要利用酶对大米蛋白的降解和修饰作用，使其变成可溶性的肽而被提取出来。因此如何对酶解得到的功能肽粗提液可进行分离纯化，以提高样品中功能肽的纯度和比活性，成为学者们关心的热点。当前对于大米源生物活性肽，主要选用离子交换层析、凝胶层析、高效液相色谱及质谱分析等技术(表1)。

2.2 大米活性肽功能与特性的研究方法

近年来，对大米活性肽的研究除主要集中在分离纯化与结构测定方面之外，对其生物活性功能的研究也逐渐被许多学者所关心，许多生物、化学方法更是被广泛应用，现结合其它生物活性肽的研究方法，将所使用或发展中的几种研究分析方法做一概述(表2)。

表1 分析方法比较

表2 功能研究方法比较

2.2.1 生物检定法

利用某些生物对某些物质(如维生素、氨基酸)的特殊需要，或对某些物质(如激素、植物激素、抗生素、药物等)的特殊反应来定性、定量测定这些物质的方法。活性肽是具有生物活性的物质，故生物检定法是研究活性肽独特而必需的方法。生物检定法有两个目的，直接测定体液中活性肽浓度以及鉴定标记活性肽的生物活性。其方法主要可分为两大类。

2.2.1.1 在体分析

直接将活性肽作用于生物，并进行相关测定的方法。常规类似的方法有胰岛素的小鼠血糖法等，此外还有根据各类生物制品的生物活性不同而建立的各异的方法，如IL－8动员中性粒细胞家兔体内的实验。这类方法最直观地反映生物活性，但涉及整体动物，供试品用量多，耗时长，精密度和灵敏度较差，变异较大。从而使离体组织分析方法越来越被研究学者所采用。

2.2.1.2 离体组织(细胞)分析

用体外组织、细胞或酶等体系测定活性肽的特异性生物学反应，通过剂量或浓度一效应曲线对被分析物定量的方法。相似的方法有NGF刺激鸡背根神经节增长、缩宫素的大鼠离体子宫法等。随着分子生物学的发展，许多灵敏度高，特异性强的依赖细胞株被建立，细胞培养成为最常用的方法。且根据作用机理的不同，具体操作亦有多种。如细胞增殖法(proliferation assays)［15］，快速灵敏，但特异性稍差;抑制增殖法(antiproliferation assays)［16］，灵敏而专一、检测系统简单;减少细胞损伤法(cytopathic effect reduction assays)［17］，是根据具有抗病毒活性的药物如干扰素，保护细胞不受病毒损伤，方法直观灵敏，但可能会受到多肽亚型的干扰。以上的方法都是以细胞数目的增减为量效指标，计数方法有直接计数法和间接计数法，后者包括MTT法，同位素(3H，14C)掺入法等。此外，还有根据活性肽与细胞间接作用进行检测，如与免疫检测联用的抗体诱导法，结合酶反应的酶诱导分解法等。

总之，生物检定法多具有灵敏特异，客观可靠的优点，但其不足也显而易见:(1)样品多存在于人或动物血清中，血清中内源物质的干扰以及可能存在的内源因子的交叉反应，影响了方法的专属性;(2)生物检定法无法定量失去活性的小代谢物，无法示踪它们的体内动态;(3)依赖株细胞长期培养易发生变异而影响检测的特异性;(4)启动生物过程常需阈量细胞因子从而降低了方法的灵敏度。

2.2.2 免疫学方法

免疫学方法是利用活性肽抗原决定簇部位的单克隆或多克隆抗体特异地识别被检活性肽，再以放射计数，比色等方法予以定量，即将特异的抗原抗体反应配以灵敏检测的方法。常用的方法有3种。

2.2.2.1 放射免疫法(radioimmunoassays RIA)

该法是被测活性肽(Ag)，标记活性肽(多为125IAg)与抗体(Ab)的竞争性结合反应，方法的特异性取决于抗原抗体的亲和力及标记活性肽的纯度，与生物检定法相比，有简明、易于控制的优点［18］。

2.2.2.2 免疫放射定量法(immunoradiometrec assays IRMA)

该法中被测活性肽依然是Ag，它先与固定相上的Ab形成Ab:Ag复合物，再与标记抗体125I-Ab结合，形成Ab∶Ag∶AD125FI-Ab夹心状。由于Ag需有两个Ab来识别，这就大大增加了方法的特异性，是一灵敏而低变异的方法，只是对标记抗体的纯度要求很高［19］。

2.2.2.3 酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assays ELISA)

ELISA的原理与IRMA相似只是第二个抗体不是用碘标，而是用可以与底物发生显色反应的酶如HRP来标记，与上述两法相比，ELISA具有使用寿命长、重复性好、无辐射源的优点，并且已有不少实验证明，它与生物检定法具有一定的量效关系及相关性［20］，提示它可部分地反映活性肽的生物活性。

免疫学方法的缺点在于:(1)它测定的是活性肽的免疫活性而不是生物活性;(2)不能同时测定代谢物，且具有抗原决定簇的代谢片段可能增加结果误差;(3)不同来源的抗体与相同的活性肽反应可能有较大的差别;(4)还可能受到内源物质的干扰。

2.2.3 同位素标记示踪法

放射性同位素标记技术是研究活性肽在生物体内处置的一种最常用的方法。所使用的同位素有125I，99mTc，3H，14C，35S 等，其中125I因其放射性高，半衰期适宜，标记制备简单而最为常用。标记方法有两种，1是内标法，即把含有同位素的氨基酸加入生长细胞或合成体系，该法对生物活性地影响可能较小，但由于制备复杂而限制了其广泛应用;2是外标法，常用化学方法如氯胺T或Iodogen法将125I连接于大分子上，因相对简单而被首选［21］。

同位素法具有简便直观，检测迅速的优点，尤其适用于活性肽的组织分布研究，但其缺点亦显而易见。同位素标记后是否会引起活性肽的生物活性及其在生物体内的代谢行为发生变化，一直存在争议。已有报道认为［22］，放射性标记法可干扰表皮生长因子与细胞的相互作用，从而导致其体内清除的紊乱。

由以上可知，现代科学技术的发展给活性肽的研究提供了多样的分析手段，随着生物化学检测技术的快速发展，大米源生物活性肽的分析检测工作也会有更大的突破。

3 大米活性肽的应用

目前对大米活性肽的研究已成为热门课题，与大米蛋白相比，活性肽具备良好的溶解性，酸、热稳定性，黏度低等理化性质，而且具有抗氧化、调节免疫力、降血压、增加食品风味等多种功能。随着生物工程技术的发展以及人们对食品功能性需求越来越高，将活性肽作为营养补充剂和功能因子添加到食品中的应用也日益广泛起来。它的添加可以改变食品的品质、风味，也能增加功能性。

3.1 应用到婴幼儿食品中

大米活性肽是低抗原性蛋白，不会产生过敏反应，而且大米活性肽中含有人体所需定额的各种氨基酸，配比合理，符合WHO/FAO推荐的理想模式，必需氨基酸比较适合2～5岁儿童的需求，将大米活性肽添加到婴幼儿配方奶粉、米粉中，也可添加到一些食物易过敏的儿童膳食中，作为重要的植物蛋白来源，有益婴儿营养吸收，促进婴幼儿生长、发育［23］。

3.2 应用到保健食品中

大米活性肽是已经被卫生部批准为具有调节免疫功能的食品成分，具有一定的药用保健价值，具有防病、治病，调节人体生理机能的功效。因此，可以作为功能性成分添加到保健食品当中［24］。

3.3 应用到烘焙食品中

大米活性肽具有保湿性，可防止面包老化。另外活性肽又是面包酵母的优良营养物质，可使酵母发酵旺盛，从而起到改善面包品质的作用。凡是在烘焙食品中添加活性肽的食品，口感口味都良好，加热的活性肽有使面包质地柔软的作用［25］。

3.4 应用到乳饮料、植物蛋白饮料中

大米活性肽具有良好的溶解性，在受热或酸碱离子浓度的条件下，抗凝性好，有较好的吸湿性，低黏度，流动性和热稳定性好。而且在体内吸收快，利用率高。在生产液态奶和植物蛋白饮料中，适量加入这样的生物活性肽，不但可以提高产品的稳定性，更可极大地提高产品的营养性和保健性，使产品的品质提升到更高的档次［26］。

3.5 应用到普通食品中

大米活性肽的低粘度、良好的吸湿性和保湿性、较强的抗氧化性使其可广泛应用于植物蛋白制品、鱼肉蛋白制品及糖果糕点中，不仅可以改善它们的质构和口感，而且可以改进它们的品质，提高保质期［27］。

3.6 起泡剂及乳化剂

经酶处理得到的大米活性肽水解液的溶解性比大米蛋白液有明显提高，同时适度地水解和脱氨作用使大米多肽的乳化能力和乳化稳定性也增加了，使其具有良好的起泡性能，可作为起泡剂用，亦可用作乳化剂［28］。

4 大米生物活性肽开发存在的问题及展望

目前，我国虽在大米生物活性肽的研究开发方面取得了一定的进展，但是还存在着许多问题，如:①对大米活性肽功能特性的开发研究主要仍处于实验室阶段，大规模的工业化生产尚未形成;②大米活性肽的分离与鉴定急需高效和灵敏的技术或分析平台;③能都作为食品添加剂的大米活性肽，其在食品加工及贮藏过程中的变化动力学少有报道;④对大米活性肽含量的检测问题、生产标准等问题尚未形成明确的方法体系，限制了其进一步的市场化。

因此，对大米活性肽的深入研究应当从以下几个方面入手:(1)深入研究大米活性肽的生理功能、释放机制、受体结合、降解失活以及类似物的结构与活性的关系，更大程度上的开发出更多生理活性功能的大米活性肽;(2)大米活性肽品种多、功能全、应用范围广、高效和无毒副作用的优点不仅仅只被应用于食品等行业，也应试图将生物活性肽应用在更多的领域(如医药、饲料等领域);(3)利用DNA重组、细胞培养等生物工程技术生产活性肽将是一种很有前景的方法，节约成本，其产量、纯度也会大大提高。(4)开发先进的分析方法对大米活性肽的安全性进行检测。其中，通过分子生物学手段来评估大米活性肽的功能机制，应该是最为行之有效的方法。可以将多种大米活性肽作用于各种细胞模型，以检测其对细胞的生理代谢活动影响，从而在分子水平上深入了解大米活性肽的功能机制，最终达到更好的在食品行业发挥大米活性肽生物功能的目的。

我国具有丰富的大米蛋白资源，其综合利用前景广阔。这些来源于大米蛋白的各种活性肽，不仅具有较高的生理活性和明确的生理功能，而且无毒无害，是天然医药保健品的宝库，有待于深入发掘。营养学家也在大力推进大米活性肽在食物中的应用。随着对大米活性肽的营养功效、生理功效及其他功能的更多、更深入的研究，大米蛋白产品的开发利用必将受到食品界的高度重视，大米活性肽必将更广泛、科学地运用于食品工业。同时，开发新型功能性米制品，以丰富食品市场，改善人们饮食结构，提高资源利用率，也将会为我国的健康事业和经济发展做出更大的贡献。

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