SPME-GC-MS分析不同商业葡萄酒酵母香气物质合成的差异性*

秦伟帅，赵新节，张娜，翟衡

1(山东农业大学园艺科学与工程学院，山东省作物生物学重点实验室，山东泰安，271018)2(山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东省微生物工程重点实验室，山东济南，250353)

挥发性香气化合物是葡萄酒中重要的风味物质，主要包括醇类、酯类、萜烯类、醛酮类和酚类等［1－2］。这些成分的种类、含量、感官阈值及其之间的相互作用影响着葡萄酒的风味和典型性。

近年来，国内外在酵母对葡萄酒香气物质的影响研究方面做了大量工作。通过研究发现，不同酵母发酵赤霞珠干红葡萄酒，酒中香气成分差别微小，而含量差别明显。Giacomo Mauriello等人对意大利葡萄酒产区的36种酵母发酵的葡萄酒进行气相色谱分析发现，不同菌株发酵的葡萄酒香气成分含量差距较大［3］。潘秋红等人研究了3种酵母对贵人香干白葡萄酒香气的影响，结果表明，不同酵母菌株的产酸、产醇和产酯能力存在很大差异［4］。目前，研究酵母香气物质代谢通常有葡萄品种香气的参与，而在模拟葡萄汁培养基中关于酵母自身香气物质合成的研究较少。在应用GC－MS技术对葡萄酒香气进行分析时，Pawliszyn等人于1990年研发出了固相微萃取技术(简称SPME)［5］。该技术高效、简单、快速且成本低。目前，已经在果实及酒类分析检测中得到广泛应用［6－7］。

本研究以4株商业葡萄酒酵母为试验材料，采用HS－SPME－GC－MS方法分析酵母代谢的香气物质，通过模拟葡萄汁发酵法研究确定酿酒酵母自身香气物质合成的差异性，为葡萄酒酿造中酵母菌株的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

商业酿酒酵母菌株:CY3079、D254、EC1118和RC212，均于2011年购自上海杰兔工贸有限公司。

1.2 试剂

香气标准品:乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、乙酸-2-苯乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇、2-苯乙醇、乙酸、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸、己酸、辛酸和癸酸，均购自美国Sigma公司;内标物4-甲基-2-戊醇(色谱醇98%)购自美国Aldrich公司;NaCl(分析纯)。

1.3 仪器与设备

手动 SPME进样器、萃取头 50/30 μm DVB/CAR/PDMS，美国 Supelco公司;GC-2010/QP 2010 Plus气相色谱-质谱联用仪，日本Shimadzu公司;Stabilwax-DA毛细管柱(30 m ×0.32 mm×0.25 μm)，美国J＆W公司。

1.4 方法

1.4.1 酵母生长条件

将酵母分别接种到3 mL YPD培养基上(1%酵母浸粉、2%蛋白胨和2%葡萄糖)，28℃培养24 h后，转接到50 mL改良的MS300培养基(葡萄糖和果糖浓度分别为60 g/L)，上25℃摇瓶好氧培养24 h。然后接种到100 mL三角瓶中厌氧发酵(含有80 mL MS300培养基)。MS300培养基成分包括:120 g/L葡萄糖、120 g/L果糖、6 g/L柠檬酸、6 g/L DL-苹果酸、300 mg/L的酵母可同化氮源(铵和氨基酸)、盐、维生素和厌氧因子(15 mg/L麦角固醇、5mg/L油酸钠和0.5 mL/L吐温 80溶解于5 mL乙醇中)［8］。MS300培养基模拟了标准葡萄汁，但是不包括葡萄的品种香气和没有气味的前体物质。酵母接种量为106个/mL(在接种之前用0.9%的NaCl清洗除去表面营养成分)。发酵温度控制在20℃;pH 3.5。每个实验设计3个重复。

1.4.2 香气物质提取

精确量取8 mL酒样放入15 mL的顶空瓶中，加入1 g NaCl，促进香气成分的挥发，再加入30 μL内标(4-甲基-2-戊醇)，立刻用PTFE/硅橡胶隔垫密封压紧。当温度到达45℃时，用DVB/CAR/PDMS的萃取头萃取50 min，进样进行气相色谱-质谱分析。

1.4.3 GC/MS条件

程序升温为30℃保持1 min，以6℃/min升至100℃，以3℃/min升温至200℃，以10℃/min升温至210℃，保持3 min。进样器温度250℃;检测器温度250℃;无分流进样。

电子轰击(EI)离子源;电子能量70 eV;离子源温度200℃;全扫描模式，质量扫描范围:30～400 u。

1.4.4 香气成分的定性与定量分析

定性分析:用气相色谱-质谱-计算机联用仪进行分析鉴定。分析结果运用计算机谱库(NIST08和WILEY7)进行初步检索及资料分析，再结合文献进行人工谱图解析，确认香气物质的各个化学成分。

定量分析:采用内加标准法进行定量。

1.4.5 酒样的感官分析

不同酵母发酵的酒样放在通风良好、无任何气味的房间内，分别由专业人员采用定量描述分析法(QDA)进行酒样感官的定性和定量评价［9］。

实验采用线性标度为评分标尺，即在1条10 cm线段上面标记出能代表某感官性质强度或数量的位置，线段最左端代表“没有”或者“0”，最右端代表“最大”或者“最强”。用直尺把每种强度转化成相应的数值，然后输入计算机进行分析。

感官评定人员各自对样品进行品评，然后独立记录能反映酒样感官特征的不同参数(即描述词汇)。由实验小组组长汇总并分类全部词汇，与小组全体人员共同讨论，确定最终的描述词汇(花香、果香、甜味、酵母味、刺激味、脂肪味、酸味)。

2 结果与讨论

2.1 发酵参数

商业酵母菌株 RC212、D254、EC1118和 CY3079分别在20℃条件下发酵，发酵结束后乙醇体积分数、残糖、总酸、挥发酸和pH值测定结果见表1。各酒样pH均为3.4。酵母D254具有较高的挥发酸水平(0.58 g/L)，而酵母 EC1118挥发酸含量最低，为0.46 g/L。各酒样残糖均低于4 g/L，其中D254具有较低的残糖含量(3.54 g/L)。RC212和EC1118酒样具有较高的总酸含量，分别为9.13和9.11 g/L。各酵母发酵酒样乙醇体积分数相差不大，RC212和D254乙醇体积分数为13.9%，比EC1118和CY3079酒样高0.1度。

表1 不同商业酵母菌株20℃条件下的发酵参数

2.2 酵母香气物质GC-MS分析

对表2中酵母发酵的酒样进行香气物质的定性定量分析发现，4种酵母自身合成的香气物质种类没有差别，共有19种，主要包括9种酯、4种高级醇和6种酸。酵母D254合成的香气物质总量为1 174.72 mg/L，在4株酵母中香气物质合成量最高;酵母CY3079和EC1118合成的香气物质总量相差不大，分别为1 066.16 mg/L和1 014.32 mg/L;酵母RC212合成的香气物质总量为987.96 mg/L，低于其他3株酵母。

高级醇是酵母代谢的主要香气物质，这类物质主要通过酵母的氨基酸合成和分解代谢途径生成［10］。研究表明，正丙醇(酒精味)、异丁醇(酒精味)、异戊醇(苦味、杂醇味、刺激味)和2-苯乙醇(花香或玫瑰花香)是酵母合成的主要高级醇。在这4种醇中，异戊醇是主要的高级醇，约占高级醇总量的50%左右。CY3079菌株高级醇生成量最高(501.66 mg/L)，其中异戊醇生成量为259.12 mg/L;D254和RC212次之，异戊醇生成量分别为238.20和223.33 mg/L;EC1118菌株高级醇的生成量最低(453.47 mg/L)，异戊醇生成量为238.70 mg/L。异丁醇检测结果表明，D254生成量最高(164.55 mg/L)，EC1118生成量最低(119.06 mg/L)。RC212具有较高的正丙醇生成能力(42.25 mg/L)。2-苯乙醇的生成量在各菌株中差别不大，均在60 mg/L左右。

由表2可以看出，酸类物质在总香气物质中含量最高，乙酸为主要组分。D254酵母具有较高的产酸能力，乙酸生成量为628.66 mg/L;菌株 CY3079和EC1118产酸能力差别不大，其中乙酸生成量分别为507.28 mg/L和502.00 mg/L;菌株RC212具有较低的产酸能力，乙酸生成量为471.26 mg/L。不同酵母菌株中链脂肪酸生成量不同。虽然C6－C10脂肪酸通常与不好的气味相关，但是它们对葡萄酒的香气平衡性非常重要［11］。菌株 EC1118具有较高的辛酸(1.81 mg/L)、己酸(1.78 mg/L)和癸酸(1.07 mg/L)的合成能力，而菌株D254的异戊酸(0.94 mg/L)和异丁酸(2.16 mg/L)合成能力较强。这类酸的出现主要与酒的果香、奶酪、脂肪和酸味有关［12］。

表2 不同酵母菌株酒样的香气物质浓度(mg/L，n=3)

本研究中4株酵母均表现出了较高的酯类物质的生成能力。由表2可以看出，酵母合成的酯类物质主要包括9种。其中乙酸乙酯(愉悦的、甜的水果香)是酵母合成的主要酯类。菌株D254乙酸乙酯的生成量最高(54.16 mg/L)，RC212最低(40.93 mg/L)。其他酯类主要包括:乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、乙酸-2-苯乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯和月桂酸乙酯。这些酯对葡萄酒香气中的花香和果香贡献非常大［1］。菌株D254总酯的生成量最大(56.79 mg/L)，比菌株 RC212(42.66 mg/L)高 14.13 mg/L。EC1118总酯生成量居中，但是具有较高的乙酸-2苯乙酯(玫瑰花香)生成能力(0.54 mg/L)。

2.3 酒样的感官分析

品评员分别对各酒样从7个感官特性进行了定量描述分析。其中的描述性词汇是评价小组按照已定义的感官特性来识别酒样给人的感觉。从图1可以看出，各酵母在相同的感官特性上所表达的每种特性的强度不同。菌株EC1118发酵的酒样花香和甜味比较明显，具有较低的刺激性。CY3079菌株刺激性比较大，RC212次之，这可能与高级醇含量高低有关。菌株D254具有较突出的果香，酸味也高于其他菌株，这可能与酒样中含有较高浓度的酯类和乙酸有关。各菌株之间脂肪味和酵母味差别不大。

图1 各酵母菌株的QDA数据蜘蛛网形图

3 结论

通过对4株商业酵母CY3079、D254、EC1118和RC212香气成分的定性定量分析表明，酵母自身合成的香气物质有19种，主要包括9种酯、4种高级醇和6种酸。有不同酵母菌株香气物质合成存在很大差别。CY3079具有较高的高级醇生成能力，其中异戊醇和2-苯乙醇的合成均高于其他酵母菌株。D254酵母具有较高的酯类和挥发酸类合成能力，其中乙酸乙酯和乙酸对酵母D254总酯和总挥发酸的含量贡献较大。EC1118高级醇生成量最低，但是具有较高的乙酸-2-苯乙酯生成能力。RC212具有较低的酯类和挥发酸的生产能力，高级醇的生成量居中。

感官品评试验表明，菌株D254的果香和酸味比较明显。CY3079酒样的刺激性比较大。EC1118具有比较突出的花香。RC212香气浓郁度适中，没有明显的刺激味。

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