硼处理对杨梅果实采后贮藏期间蔗糖代谢及花色苷合成的影响*

汪开拓，郑永华

1(重庆三峡学院生命科学与工程学院，重庆，404100)2(南京农业大学食品科技学院，江苏 南京，210095)

杨梅(Mycira rubra Sieb.et Zucc.)为我国特产的浆果类水果，加工和消费需求量很大，商业价值很高。同时，杨梅果实中还富含多种可溶性糖及多酚、花色苷和类黄酮等抗氧化物质，因而赋予杨梅果实浓郁的风味、鲜艳的色泽以及较高的抗氧化活性［1］。这其中，蔗糖及花色苷含量是决定采后杨梅果实品质的主要因素［2］。近年来，对我国广泛种植的杨梅品种——“乌种”杨梅果实(Mycira rubra Sieb.et Zucc.Cv Wumei)采后生理的研究表明，其采后果实组织中蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)和合成方向的蔗糖合成酶(sucrose synthase，SS)活性一直维持在较高水平，从而催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和磷酸果糖或果糖合成蔗糖，促进杨梅果实在采后贮藏期间蔗糖的积累［3］;但笔者先前研究发现，“乌种”杨梅果实主要花色苷类物质的矢车菊-3-葡萄糖苷含量在贮藏期间缓慢下降［4］。由于蔗糖以及矢车菊-3-葡萄糖苷合成的主要前体物质均为UDPG，因此推测植物花色苷和蔗糖合成之间可能存在一定的底物竞争关系［5－7］。通过对采后杨梅果实蔗糖代谢和苯丙烷类代谢的调控，平衡蔗糖和花色苷合成对底物的竞争关系，可有效促进杨梅果实采后品质的形成，提升果实风味和功能性。

硼作为果树生长发育以及果实品质形成所必需的微量元素，具有稳定叶绿素和花色苷结构、促进碳水化合物运输以及蛋白质合成的作用，即在果实采后糖代谢以及花色苷合成等方面具有重要的调控作用［8］。同时，研究表明大鼠硼元素急性中毒的LD50为550～710 mg/kg，因此外源硼处理的安全性较高［9］。有文献报道，采后富硼处理可有效减轻桃果实采后果心褐变程度［10］，显著抑制采后葡萄灰霉病［11］和红枣青霉病［12］的发生，同时提高番茄果实番茄红素的合成［12］。但现阶段有关硼元素在杨梅果实采后贮藏期间蔗糖代谢以及花色苷合成中的作用却尚未见报道。因此，本研究首先分析了不同浓度外源硼处理对杨梅果实内源硼含量以及冷藏期间杨梅果实品质的影响，再从蔗糖代谢和花色苷合成的角度探讨硼元素调控采后杨梅果实品质形成的机理。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与主要试剂

以重庆市万州区燕山乡种植的“乌种”杨梅果实(Mycira rubra Sieb.et Zucc.Cv.Wumei)为试材，采摘期分别为2010年6月和2011年6月，于采收后2 h内运回实验室。挑选无病虫害和机械伤且大小基本相同、着色均匀的八分熟杨梅果实，平摊自然风预冷。

FHM－5型果实硬度计，浙江托普仪器有限公司;PAL－1型手持数显折光仪，北京首选科技有限公司;PHS－3C酸度计，中山科技发展公司;UV－1600型分光光度计，上海美谱达仪器有限公司;5424型台式冷冻离心机，德国艾德本公司;GHP－9080型隔水式电热恒温培养箱，上海申贤恒温设备厂;PL601－S型电子天平，梅特勒-托利多公司;DW－40L92超低温冰箱，海尔公司;LC－20A型高效液相色谱仪，日本岛津公司。

姜黄素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、Triton X－100、二硫苏糖醇(DTT)国药集团化学试剂有限公司;乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、G-250考马斯亮蓝上海化学试剂公司;3，5-二硝基水杨酸(DNS)、蒽酮、MgCl2西陇化工有限公司;6-磷酸果糖、UDPG、矢车菊-3-葡萄糖苷 美国Sigma公司;甲醇、甲酸、乙腈、葡萄糖、果糖和蔗糖为国产色谱纯，其余试剂为国产分析纯。

1.2 材料处理

实验分2次进行。第一次实验的主要目的是筛选最适硼(四硼酸钾)处理浓度。以2010年采摘的杨梅果实为试材，首先将挑选出的杨梅果实随机分为10组，在实验台上平摊开，再分别用0(对照)、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50 和 100 g/L 的四硼酸钾溶液进行喷洒处理(环境温度20℃)。处理结束后，将各处理果实通风2 h，其中部分果实用无菌手术刀仔细切取果实肉柱后测定其中硼元素含量，其余各处理组果实用的聚乙烯塑料盒(20 cm×12 cm×8 cm)分装，于(1±1)℃、(90±5)%RH下贮藏12 d后测定果实腐烂率、硬度、pH值、可溶性固形物和可滴定酸含量。每个处理约300颗左右杨梅果实，分装20盒左右，整个实验重复3次。

第二次实验在2010年实验的基础上，以经研究确定的10 g/L四硼酸钾喷洒处理杨梅果实、研究硼元素对杨梅果实贮藏期间蔗糖代谢及花色苷合成的调控机制。试材为2011年采摘的杨梅果实，将挑选出的杨梅果实随机分为2组，处理组用1%四硼酸钾进行喷洒处理，而对照组则用无菌水进行处理。处理结束后，将杨梅果实通风2 h后用聚乙烯塑料盒分装，再在(1±1)℃、(90～95)%RH环境中贮藏12 d。分别在果实处理前(0 d)和处理后冷藏期间每隔3 d取样，用液氮速冻后在－60℃的超低温冰箱中保存，用于蔗糖代谢酶活性、可溶性糖和花色苷单体含量的测定。每个处理约500颗杨梅果实，分装为35盒左右，整个实验重复3次。

1.3 指标测定

1.3.1 腐烂率

杨梅果实表面出现霉菌性病斑即记为烂果。

腐烂率/%=(烂果数/总果数)×100

1.3.2 果实可溶性固型物含量(TSS)、可滴定酸含量(TA)和pH值测定

用手持数显折光仪测定 TSS含量;采用标准NaOH滴定法测定TA含量，结果以苹果酸百分含量表示。用pH计(PHS－3C)测定果汁的pH值。

1.3.3 果实硬度测定

采用手持果实硬度计测定杨梅果实硬度(kg/cm－2)。

1.3.4 硼元素含量测定

取5 g果实冻样用质量分数2%NaOH溶液匀浆后转移至250 mL锥形瓶中，然后在35℃下低速旋转蒸发至约10 mL，再加入5 mL 1∶1硫酸后用蒸馏水定容至50 mL待测。杨梅果实中硼元素含量参照姜黄素比色法进行测定［13］，结果以mg/kg鲜重表示。

1.3.5 蔗糖酸性转化酶(AI)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、分解方向的蔗糖合成酶(SS1)和合成方向的蔗糖合成酶(SS2)活性的测定

蔗糖代谢相关酶参照陈俊伟等［3］的方法进行提取，略有改进。取10 g果实冻样经真空冷冻干燥后冰浴研磨成粉末，加入提取缓冲液(内含50 mmol/L Hepes-KOH、5 mmol/LMgCl2、1 mmol/LEDTA、1 mmol/L EGTA、10% 甘油、0.1%Triton X-100、5 mmol/L DTT、0.5 mmol/L PMSF、1 g/L PVPP，调 pH 值至 8.2)50 mL并冰浴匀浆，随后冷冻离心20 min(10 000×g、2℃)，取上清液装入透析袋内，于2℃下过夜脱盐后测定酶活性和蛋白质含量。以考马斯亮蓝法［14］测定提取液中蛋白质含量。

AI活性参照Lowell等［15］的方法进行测定，反应体系内含30 mmol/L醋酸-磷酸钾缓冲液(pH 4.5)、50 mmol/L蔗糖以及酶提取液，30℃下水浴反应1 h后用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定反应液中还原糖含量。以反应液1 h生成1 μmol还原糖为一个酶活性单位;SPS活性参照Hubbard等［16］的方法进行测定，反应体系内含50 mmol/L Tris-HCL缓冲液(pH 7.5)、15 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L 6-磷酸果糖、2 mmol/L UDPG以及酶提取液，30℃下水浴反应1 h后用蒽酮比色法测定其中反应液中总糖含量，以反应液1 h生成1 μmol总糖为一个酶活性单位;SS1和SS2活性参照赵智中等［17］的方法进行测定，SS1反应体系内含50 mmol/L醋酸缓冲液(pH 5.5)、1 mmol/L UDP、20 mmol/L 蔗糖以及酶提取液;SS2反应体系内含50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)、5 mmol/L MgCl2、15 mmol/L 果糖、2 mmol/L UDPG以及酶提取液，30℃下水浴1 h后测定其中还原糖含量，以反应液1 h生成1 μmol还原糖为一个酶活性单位。以上结果均以U/mg蛋白表示。

1.3.6 可溶性糖组分含量测定

可溶性糖组分含量的测定参照Cao等［18］的方法进行。取2 g果实冻样用20 mL 95%冷乙醇匀浆，震荡提取10 min，在冷冻离心15 min(10 000 ×g、2℃)，取沉淀物用体积分数95%冷乙醇以相同流程进行复提。合并2次上清液于35℃下旋转蒸发直至乙醇全部挥发，残留组分用超纯水定容至25 mL，再用孔径为0.45 μm纤维膜微滤后进行HPLC分析。可溶性糖组分含量采用岛津LC－20A型高效液相色谱仪进行测定。该色谱仪由以下几个部分组成:在线脱气装置(DGU－14A)，二元泵(LC－20AT)，柱温箱(CTO－20AC)和示差折光检测器(RID－10A)。手动进样，进样体积为20 μL。分析色谱柱为Zorbax糖分析柱，250 mm × 4.6 mm i.d.，10 μm，柱温为 35℃，流速0.8 mL/min，流动相为75%的乙腈。以外标法测定可溶性糖组分含量，其结果均以mg/g鲜重表示。

1.3.7 花色苷和矢车菊-3-葡萄糖苷含量测定

取1 g果实冻样用5 mL丙酮匀浆并离心，取上清液用于总花色苷及其单体矢车菊-3-葡萄糖苷含量的测定。采用Cheng和Breen［19］的pH差异法测定果实总花色苷含量;同时将上清液经旋转蒸发后过C18Sep-Pak(Supelco公司)萃取小柱后再经0.45 μm孔径的纤维膜过滤，取滤液参照笔者先前的高效液相色谱法测定其中矢车菊-3-葡萄糖苷含量［20］。以上结果均以mg/g鲜重表示。

1.4 数据分析

以上各指标测定除腐烂率和硬度重复10次外，其余指标均重复3次。运用SPSS 18.0软件进行数据处理分析，用邓肯氏多重比较方法进行差异显著性检验，5%为显著水平，1%为极显著水平。

2 结果与分析

2.1 不同浓度硼处理后杨梅果实中硼元素含量变化

如图1所示，经0.1 g/L硼处理后的杨梅果实中硼元素含量较对照水平相比无显著(P＞0.05)差异;而浓度高于0.5 g/L的硼处理均可显著(P＜0.05)提高杨梅果实中硼元素含量，且果实中硼元素含量随硼处理浓度的上升而逐渐增加;但当硼处理浓度高于10 g/L时，各处理后杨梅果实中硼元素含量无显著(P＞0.05)差别，暗示杨梅组织对硼元素吸收能力达到饱和状态。因此，综合图1的结论，选择浓度为0.1、1.0、5.0和10 g/L的硼处理来进行杨梅保鲜实验。

图1 不同浓度硼处理后杨梅果实中硼元素含量变化

2.2 不同浓度硼处理对杨梅果实贮藏品质的影响

贮藏前的杨梅果实硬度为(4.31±0.09)kg/cm2;可溶性固形物和可滴定酸含量经测定分别为(10.24±0.15)%和(0.86±0.07)%。

如表1所示，对照杨梅果实在1℃贮藏12 d后，其腐烂率达到39.42%;同时，果实中硬度、TSS和TA含量也较贮藏前分别下降了14.38%、8.49%和19.05%，这些数据显示冷藏12 d后杨梅果实食用品质明显下降，基本失去商品性。而经0.1～10 g/L的硼处理可显著(P＜0.05)抑制杨梅果实在贮藏期间腐烂率的上升，并在一定程度上维持果实TSS和TA含量，从而维持了果实品质。其中，经5～10 g/L硼处理杨梅果实的腐烂率均显著(P＜0.05)低于0.1和1 g/L处理组，10 g/L硼处理的杨梅果实TA含量又显著(P＜0.05)高于5 g/L硼处理。综合品质结果表明，10 g/L硼处理对杨梅果实保鲜效果最佳，以此处理作为下一步机理研究的处理条件。

2.3 10 g/L硼处理对杨梅果实采后贮藏期间蔗糖代谢酶活性的影响

如图2所示，对照杨梅果实在1℃贮藏期间，其酸性转化酶(acid invertase，AI)活性随贮藏时间延长而缓慢上升，而SPS则在贮藏期间急剧上升，至贮藏结束时，SPS活性为贮藏前的1.21倍;SS1(蔗糖合成酶分解方向)活性在贮藏前3 d明显上升，随后缓慢上升;SS2(蔗糖合成酶合成方向)活性则在贮藏期间无显著变化。这些结果显示，杨梅果实在贮藏期间，其组织内蔗糖呈缓慢合成趋势。10 g/L硼处理显著(P＜0.05)延缓了杨梅果实在贮藏期间AI和SPS活性在贮藏期间的上升，并抑制了SS2活性的上升;但10 g/L硼处理却显著(P＜0.05)诱导了SS1活性的上升，使处理果实中SS1活性在整个贮藏期间均显著(P＜0.05)高于对照果实。由此可推测，经10 g/L硼处理后，杨梅果实蔗糖合成受到明显抑制的同时，蔗糖分解速率加快，从而使蔗糖代谢中间产物UDPG逐渐积累。

表1 不同浓度硼处理对1℃贮藏12 d后杨梅果实品质指标的影响

图2 1%硼处理对贮藏期间杨梅果实中AI(A)、SPS(B)、SS1(C)和SS2(D)活性的影响

2.4 10 g/L硼处理对杨梅果实采后贮藏期间可溶性糖组分的影响

葡萄糖、果糖和蔗糖为杨梅果实中主要的可溶性糖。如图3所示，对照杨梅果实在1℃贮藏期间，其果糖含量基本保持稳定;葡萄糖含量在贮藏前6 d逐渐上升，随后呈现急速下降趋势;而蔗糖含量在贮藏前6 d无显著变化，随后逐渐上升。经10 g/L硼处理的杨梅果实中葡萄糖和蔗糖含量在整个贮藏期间均显著(P＜0.05)低于对照果实，而处理果实中果糖含量却在贮藏6 d后逐渐高于对照果实。

2.5 10 g/L硼处理对杨梅果实采后贮藏期间总花色苷和矢车菊-3-葡萄糖苷(C3G)含量的影响

如图4所示，对照杨梅果实在1℃贮藏期间，其总花色苷含量及其主要单体物质矢车菊-3-葡萄糖苷含量无显著(P＞0.05)变化，10 g/L硼处理显著(P＜0.05)促进了杨梅果实在贮藏期间花色苷以及花色苷主要单体物质矢车菊-3-葡萄糖苷的积累，使处理果实中总花色苷和矢车菊-3-葡萄糖苷含量在整个贮藏均显著(P＜0.05)高于对照水平。

3 讨论

3.1 最佳硼(四硼酸钾)处理浓度的筛选

本研究结果证实杨梅果实内硼元素的积累随硼(四硼酸钾)处理浓度的上升而显著增加，但当处理浓度大于10 g/L时，果实内硼元素含量不再明显增加，由此推测10 g/L为杨梅果实最大有效硼处理浓度。同时，研究发现10 g/L硼处理可以显著降低杨梅果实采后贮藏期间腐烂率，并显著延缓果实TSS、TA和硬度的下降，从而全面维持了果实食用品质，这与前期有关0.5～10 g/L硼处理有效抑制如葡萄［11］和红枣［12］采后腐烂发生和品质下降的结论相一致，其机理可能是由于硼元素可直接破坏果实病原菌细胞膜结构从而阻止病原菌的侵染，而小于10 g/L的硼处理抑菌效果有限［10］。

图3 1%硼处理对贮藏期间杨梅果实中葡萄糖(A)、果糖(B)和蔗糖(C)含量的影响

图4 10 g/L硼处理对贮藏期间杨梅果实中总花色苷(A)和矢车菊-3-葡萄糖苷(B)含量的影响

3.2 硼处理对杨梅果实蔗糖代谢及花色苷合成的调控机制分析

在果实品质形成过程中，其组织内蔗糖主要通过磷酸蔗糖合酶和蔗糖合酶2种途径进行合成，同时类黄酮、酚酸和花色苷等抗氧化成分的合成则主要通过苯丙烷类代谢途径进行，而UDPG是这几种代谢途径共同的中间体:UDPG既是苯丙烷类代谢途径中合成花色苷类物质中碳骨架的主要底物，同时也作为磷酸蔗糖合酶途径中葡萄糖的供体并且为蔗糖合酶途径中蔗糖的合成提供活化的单糖基［21］;而UDPG含量主要由蔗糖代谢相关酶进行调控:SPS可催化UDPG和6-磷酸果糖合成6-磷酸蔗糖，而6-磷酸蔗糖可迅速降解成蔗糖和磷酸根离子;SS1(蔗糖合酶合成方向)可催化UDPG和果糖合成蔗糖，而SS2(蔗糖合酶分解方向)可将蔗糖反向分解为UDPG和果糖;IA可催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖，从而维持细胞渗透压、调节蔗糖和己糖的贮存并为UDPG的合成提供底物［22］。在本实验中，10 g/L硼处理显著降低了杨梅果实在1℃贮藏期间AI、SPS以及SS2的活性，并有效诱导了SS1活性的上升;同时经过10 g/L硼处理的杨梅果实在整个贮藏期间，其葡萄糖和蔗糖含量却显著低于对照果实。结合硼处理可提升杨梅果实内硼元素含量的结论，由此推断硼元素可直接调控杨梅果实中蔗糖代谢酶活性，即通过降低杨梅果实贮藏期间AI、SPS以及SS2活性从而降低6-磷酸蔗糖和蔗糖合成速率，使中间产物UDPG积累;同时通过诱导果实SS1活性的上升来促进蔗糖分解为UDPG。另一方面，10 g/L硼处理可显著促进杨梅果实在贮藏期间总花色苷和花色苷主要单体物质矢车菊-3-葡萄糖苷的合成，而UDPG则是花色苷合成途径——苯丙烷类代谢途径中重要的前体物质。因此，这些结论说明硼元素可通过调控杨梅果实贮藏期间蔗糖代谢酶活性来减慢蔗糖合成速率并降解蔗糖以积累UDPG，从而为杨梅果实花色苷的合成提供底物，最终达到促进果实中功能性物质的积累并改善果实的贮藏品质的目的，这些结论与有关蔗糖分解积累UDPG促进模式植物拟南芥花色苷积累的结论基本一致［7］。但硼元素在采后杨梅果实中的形态及其具体功能还有待进一步研究。

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