茶多糖的分离纯化及其抗凝血活性*

谢亮亮，蔡为荣，张虹，陈勇

(安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽 芜湖，241000)

随着人民生活水平的提高和饮食结构的改变，高脂及其引发的血栓性疾病已日益危害人们健康［1］。肝素多糖已在血栓性疾病治疗中发挥相当重要的作用，但易诱发血小板减少等副作用［2］，从天然产物中寻找抗凝血活性成分，或将其主结构作为先导化合物进而研发新药，或开发功能性食品，具有毒性小、研发费用低、周期短和全民保健的优势［3］。

茶叶起源于中国，是古代文献记载最早的天然药物之一。在我国和日本民间有常饮用粗老茶来治疗糖尿病的经验［4］。而我国茶叶年产量60万t左右，其中粗老茶约10万t，在市场上中低档茶严重滞销，在茶叶生产过程中产生的大量低质茶叶，由于丧失饮用价值而被废弃，茶叶功能活性的开发研究已受人们关注［5］。清水岑夫从番茶中冷水浸提的茶多糖(tea polysaccharides，TPS)具有降血糖效果，是由葡萄糖、D-核糖、阿拉伯糖组成。Takeo报道有降糖作用的茶多糖由半乳葡聚糖组成。聂少平报道［6］冷水与沸水提取的粗茶多糖清除DPPH自由基相差数倍。Monbe等［7］发现，茶多糖可以明显增加HL60细胞的免疫能力。显示出茶多糖具有多种生理功能，原料及提取分离纯化技术的不同，制得的茶多糖组分、结构及生理活性有所差异。目前报道的具有抗凝血多糖多为来源于海藻的硫酸化多糖，从粗老茶叶末中提取多糖及抗凝血活性研究报道甚少。因此，本文选取中低档茶叶末，提取其多糖，分离纯化，进而研究了其组成，及抗凝血活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粗茶叶末，购于芜湖老三届茶行;聚酰胺(80～100目)，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂;DEAE Sepharose CL－6B，Pharmacia公司;透析袋，北京瑞达恒辉科技发展有限公司;Dextran T系列，Pharmacia公司，色谱纯;考马斯亮蓝(G－250)，Sigma公司;APTT、PT和TT试剂盒，上海太阳生物科技有限公司;浓硫酸、苯酚、无水乙醇、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等试剂，均为国产分析纯。

TH－1000梯度混合器、HL－1S恒流泵、BS－100A自动部分收集器、旋转蒸发器RE－52，上海青浦沪西仪器厂;层析柱，江阴市新辉层析设备有限公司;HH－6数显恒温水浴锅，国华电器有限公司;高速离心机，上海安亭科学仪器厂;真空冷冻干燥机，美国SIM公司;IRPretige-21傅立叶变换红外光谱仪、UV－3600紫外可见分光光度计，日本岛津;Waters 600高效液相色谱仪，配2410示差折光检测器及Empower工作站，美国Waters公司;Sysmex CA－1500凝血仪，日本Symex公司。

1.2 实验方法

1.2.1 茶多糖的提取

采用水提醇沉［8］提取茶多糖，条件为料液比1∶20，温度60℃，时间90 min。提取液过滤除去杂质后浓缩，浓缩到原体积的1/5缓缓加入无水乙醇，使乙醇终浓度达到80%，醇沉24 h后离心去除上清液，冷冻干燥得粗多糖(crude tea polysaccharides，CTPS)。

图1 茶多糖提取流程图

1.2.2 粗茶多糖的脱色去蛋白

称取1 g粗多糖溶于50 mL蒸馏水中，经时间为10 min，转速为4 000 r/min离心后上聚酰胺柱(2.6 cm×60 cm)，以蒸馏水为流动相，流速为1.0 mL/min，每管收集4 mL，用苯酚-硫酸法［9］跟踪检测，在420 nm［10］下测量多糖溶液的吸光度确定多糖的脱色率，考马斯亮蓝G250比色法［11］测定蛋白含量及蛋白去除率。

式中:OD脱色前、OD脱色后分别为脱色前后茶多糖溶液在420 nm的吸光度。

式中:m去除前、m去除后分别为多糖脱蛋白前后溶液中蛋白质的质量。

式中:m糖1、m糖2分别是脱蛋白前后的多糖质量。

1.2.3 茶多糖的紫外可见和红外光谱分析

取100 μg/mL 茶多糖水溶液在 200～700 nm［12］内进行全波长扫描，观察紫外可见光谱特征。称取2 mg多糖样品，采用KBr研磨压片，用 IRPretige－21傅立叶变换红外光谱仪在4 000～500 cm－1区间［13］内进行红外扫描，观察其红外光谱特征。

1.2.4 茶多糖的分离纯化

取100 mg茶多糖溶于20 mL磷酸盐缓冲溶液(0.02 mol/L，pH 5.9)，离心除去不溶物，转速为10 000 r/min，时间为10 min，取上清液上离子交换层析柱(1.6 cm×60 cm)，分别用pH 5.9的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液和0.1～0.5 mol/L的NaCl进行梯度洗脱，流速为2 mL/min，每管收集10 mL，用苯酚-硫酸法跟踪检测。

1.2.5 分子量的测定

用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)［14］测定分离纯化后的茶多糖样品，色谱条件为色谱柱:UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mmid×2;流动相:0.1 mol/L NaNO3;流速:0.9 mL/min;柱温:45℃。样品溶于流动相，用0.45 μm微孔膜过滤后进样，进样体积20 μL。

1.2.6 茶多糖的体外抗凝血

新鲜静脉血与3.2%的柠檬酸钠按体积比9∶1混合均匀，以4 000 r/min离心10 min。多糖样品和血浆按1∶4的体积比进行混合，活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)和凝血酶时间(thrombin time，TT)测定的实验方法和步骤按照试剂盒和仪器说明进行，以肝素钠和生理盐水代替待测样品分别作为阳性和阴性对照。

2 结果与讨论

2.1 茶多糖的提取与纯化

按1.2.1法，将200 g茶叶粉末经水提、过滤、乙醇沉淀后得茶叶粗多糖6.702 g，提取率为3.351%。制得的CTPS呈棕褐色，示含色素及蛋白质，经1.2.2法脱色去蛋白。茶多糖聚酰胺柱洗脱曲线(图2)显示，前40管吸光度很小，40～100管有吸收，收集40～100管的液体，经浓缩、醇沉、冷冻干燥后得到白色的茶多糖(D-TPS)。脱色率、蛋白去除率和多糖保留率分别为75.1%、91.2%和79.2%，表明聚酰胺对茶多糖基本没有吸附作用，聚酰胺具有脱色、脱蛋白的双重功效。紫外光谱图显示(图3)，在260～280 nm时D-TPS比TPS吸光度明显下降，仍有较宽的特征吸收峰，表明多糖含有蛋白质。

图2 茶多糖聚酰胺柱洗脱曲线

图3 茶多糖的紫外可见光谱图

茶多糖的红外光谱图(图4)显示，D-TPS在3 600～3 200 cm－1区间出现一种O—H的伸缩振动宽峰，3 000～2 800 cm－1出现糖类特征吸收峰C—H，1 665～1 635 cm－1的特征吸收峰表明多糖带有结晶水，此外在1 653 cm－1出现多糖中乙酰氨基的C O伸缩振动，说明多糖中含有氨基酸残基，在1 400～1 200 cm－1所看到的不太尖的吸收峰是C—H的变角振动，1 200～1 000 cm－1间较大的吸收峰是由一种属于C—O—H和另一种糖环的C—O—C的2种C—O伸缩振动所引起的，795 cm－1的特征吸收峰则表明茶多糖是呋喃型多糖。

图4 D-TPS红外光谱图

以管数为横坐标，吸光度为纵坐标的茶多糖洗脱曲线(图5)，采用DEAE Sepharose CL－6B离子交换柱对茶多糖进行分离纯化，经磷酸盐缓冲溶液(0.02 mol/L，pH 5.9)、0.1、0.2、0.5 mol/L 的 NaCl溶液阶段梯度洗脱后得到4个吸收峰，分别合并收集主峰洗脱液，然后浓缩、透析72h、冷冻干燥后得到白色絮状固体，分别为 TPS-1、TPS-2、TPS-3、TPS-4。得率分别为13.4%、27.4%、15.9%和17.1%，总的多糖回收率为73.8%。结合离子交换和NaCl浓度可以得出这样结论，TPS-1为中性糖，TPS-2、TPS-3和TPS-4为酸性多糖，而且所带电荷量在不断递增。

图5 茶多糖DEAE Sepharose CL-6B柱层析洗脱曲线图

2.2 纯度鉴定与分子量分布

HPGPC是按分子筛原理进行分离的，不仅可以检测多糖的纯度，同时可以测定多糖的分子量及其分布。经GPC软件处理，以标准葡聚糖分子量的对数Log Mol Wt对保留时间(retention time)进行回归，其葡聚糖Dextran系列标准品校正曲线方程为Log Mol Wt=12.14－0.392tR(tR为保留时间)，相关系数r=0.995 0。茶多糖4个组分的高效凝胶渗透色谱如图6，其分析结果见表1。TPS-1、TPS-2和TPS-3均为单一峰，表明其为均一多糖，其分子量分别为20 760、24 230和250 643。TPS-4的HPGPC图谱显示出两个峰，可见TPS-4多糖中主要含有2个组分，其分子量分别为689 113和4 150，表明TPS-4为非均一多糖，因此需进一步用凝胶过滤色谱对其分离。所得茶多糖的分子量与之前报道不一样［15－16］，可能与茶多糖的原料和提取方法不一致有关。

图6 TPS-1、TPS-2、TPS-3 和 TPS-4 高效凝胶渗透色谱图

2.3 多糖的体外抗凝血活性

在医学检验中，APTT、PT和TT 3项指标常常用于确定血液凝固的途径，APTT是测定内源性凝血系统状况和共同途径的筛选实验，PT是测定外源性凝血状况的筛选实验，TT是测定血浆中纤维蛋白原转化为纤维蛋白能力的筛选实验。采用Minitab 15软件进行统计学分析，APTT、PT、TT检测结果用平均值±标准差，显著性差异采用t－配对分析。从茶多糖体外抗凝血实验结果可知，茶多糖及其各个组分都可以延长APTT时间，但各组分对PT基本没有影响。其中TPS-4可以显著的增加APTT和TT的时间，分别延长了24.2%和22.8%，表明茶多糖TPS-4是通过内源性、共同途径以及具有把纤维蛋白原转化为纤维蛋白来影响凝血过程的。

表1 茶多糖的高效凝胶渗透色谱结果

表2 多糖的体外抗凝血活性实验结果

3 结论

(1)在茶多糖的提取过程中用聚酰胺对多糖进行脱色脱蛋白，其脱色率、蛋白去除率和多糖保留率分别为75.1%、91.2%和79.2%，能够有效的脱色和去除溶液中的蛋白质。红外谱图显示D-TPS有多糖类物质的特征吸收峰，茶多糖的全波长扫描表明茶多糖带有氨基酸残基。

(2)茶多糖经DEAE Sepharose CL－6B离子交换柱分级纯化后得到4个组分，分别为TPS-1、TPS-2、TPS-3、TPS-4，得率分别为 13.4%、27.4%、15.9% 和17.1%，多糖的总回收率为73.8%，其中TPS-1、TPS-2、TPS-3为单一对称峰，分子量分别为20 760、24 230和250 643，为均一多糖，TPS-4含有2个组分，其分子量为689 113和4 150，为非均一多糖。

(3)体外抗凝血实验显示多糖各个组分都可以延长APTT时间，但对PT没有影响，其中TPS-4可以显著延长APTT和TT时间，分别延长了24.2%和22.8%，表明TPS-4具有抗凝血效果。

［1］王有国.血粘导致脑梗阻［J］.中国心血管病研究杂志，2001(2):19－20.

［2］Ekanayake P M，Nikapitiya C，Zoysa M D，et al.Novel anticoagulant compound from fermented red alga Pachymeniopsis elliptica［J］.European Food Research and Technology，2008，227:897－903.

［3］周永国，杨越冬，王树元，等.天然活性多糖在生物医药领域中的研究进展［J］.高分子通报，2006，(9):16－23.

［4］Nie S P，Xie M Y.A review on the isolation and structure of tea polysaccharides and their bioactivities［J］.Food Hydrocolloids，2011，25:144－149.

［5］陈海霞，高活性茶多糖的一级结构表征、空间构象及生物活性的研究［D］.武汉:华中农业大学，2002.

［6］聂少平，谢明勇，罗珍.用清除有机自由基DPPH法评价茶叶多糖的抗氧化活性［J］.食品科学，2006，27(3):34－36.

［7］Monobe M，Ema K，Azuma K，et al.Enhancement of phagocytic activity by a crude polysaccharide from tea(Camellia sinensis)extract［J］.Animal Cell Technology:Basic＆ Applied Aspects，2010，16:333－338.

［8］陈小蒙，刘成梅，刘伟.龙牙百合多糖的纯化及其分子量的测定［J］.食品科学，2008，29(11):305－307.

［9］张惟杰.糖复合物生化研究技术［M］.杭州:浙江大学出版社，1994:16－17.

［10］王元凤，金征宇.茶多糖脱色的研究［J］.食品与发酵工业，2004，30(12):60－64.

［11］Marion M.Bradford.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72:248－254.

［12］江和源，陈小强，寇小红，等.茶多糖的分级纯化及组成分析［J］.茶叶科学，2007，27(3):248－252.

［13］Yang W，Pei F，Shi Y，et al.Purification，characterization and anti-proliferation activity of polysaccharides from Flammulina velutipes［J］.Carbohydrate Polymers，2012，88(2):474－480.

［14］易剑平，叶晓，钟儒刚.高效凝胶渗透色谱法测定枸杞多糖的分子量［J］.中草药，2006，27(2):214－215.

［15］Wang L M，Xia W S.Isolation and analysis of a novel acidic polysaccharide with glucokinase-stimulating activity from coarse green tea［J］.Journal of Food Biochemistry，2006，30:187－202.

［16］Chen H X，Zhang M，Qu Z S，et al.Antioxidant activities of different fractions of polysaccharide conjugates from green tea(Camellia sinensis)［J］.Food Chemistry，2008，106:559－563.