油茶籽壳原花青素的分离纯化*

余红军，郑生宏，李立祥

1(浙江绿世界生物工程有限公司，浙江湖州，313300)2(浙江丽水市农业科学研究院，浙江丽水，323000)3(安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术教育部、农业部重点实验室，安徽合肥，230036)

原花青素(proanthocyanidins，简称PC)是由单体黄烷-3-醇类物质以不同聚合度连接而成的多酚类化合物，有人将其归为缩合鞣质［1－3］。这类化合物由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成，最简单的是儿茶素、表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体［4－5］。研究表明，原花青素具有广泛的生化和药理活性，如抗氧化、清除自由基、护肝解毒、抗菌及抗癌等功能;目前已经成为医药、保健品的重要原料及食品、化妆品的重要添加剂;它广泛存在于各种植物(如葡萄、银杏、白桦树等)的核、壳、种籽中［6－7］。

目前，国内外学者对原花青素的研究主要集中在葡萄籽、沙棘、山楂等材料［8，9］，对油茶籽壳中原花青素的研究较少，而中国油茶(Camellia oleifera Abel)资源丰富，据统计，全国现有油茶面积400多万hm2，年产油茶籽60万t，因此，充分利用油茶籽资源，不仅变废为宝，且还会带来巨大的经济效益［10－11］。本文利用Sephadex LH－20柱色谱分离纯化油茶籽壳原花青素，并对柱层析纯化得到的原花青素进行分析和鉴定，为油茶籽壳中原花青素的进一步研究和应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

油茶籽壳，安徽黄山谢裕大茶业有限公司提供;原花青素对照品(天津尖峰天然产物有限公司，源自葡萄籽，纯度＞95%);GA(没食子酸)、GC(没食子儿茶素)、EGC(表-没食子儿茶素)、C(儿茶素)、EC(表-儿茶素)、EGCG(表-没食子儿茶素酸酯)、ECG(表-儿茶素没食子酸酯)，Sigma公司;色谱级甲醇、乙腈、醋酸(美国Tedia公司);香草醛(天津市光复精细化工研究所);乙醇(分析纯，上海振企化学试剂有限公司);葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(Pharamacia biotech公司);其他试剂均为分析纯，水为去离子水。

1.2 主要仪器

UV－2102C型紫外可见分光光度计(上海尼龙科仪器有限公司);U3010紫外分光光度计(日本日立公司);DHG－9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司);HH－6型电热恒温水溶锅(江苏金坛市荣华仪器制造有限公司);KQ－500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Waters－600高效液相色谱仪(美国Waters公司);LGJ－12冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)AB104-N型电子天平(Mettlet-Toledo Group);SENCO R系列旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司);JFSD－100粉碎机(上海嘉定粮油仪器有限公司);BECKMAN COULTER Avanti J－30I型高速冷冻离心机(美国贝克曼公司);层析柱(2.5 cm×50 cm，上海锦华实验器械厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 材料的预处理

将油茶籽壳放于烘箱中40℃条件下烘4 h，取出后用粉碎机粉碎至100目，后置于干燥器中备用。

1.3.2 原花青素的提取［12］

准确称取2.0 g100目的油茶籽壳粉于100 mL具塞三角瓶中，按1∶70(g∶mL)的料液比加入体积分数(下同)60%的乙醇溶液140 mL，在60℃下用300 W的超声功率浸提30 min，后冷却至室温，离心(5 000 r/min，10 min，常温)，取上清液，经旋转蒸发(60℃)浓缩至1/10体积左右，然后加入4倍体积的95%乙醇，搅拌均匀后置4℃冰箱中静置12h，离心(5 000r/min，10min，4℃)，上清液即为原花青素粗提液。

1.3.3 原花青素的 Sephadex LH－20凝胶柱纯化［13］

葡聚糖凝胶Sephadex LH－20预先用体积分数为60%乙醇充分溶胀，缓慢倒入层析柱(2.5 cm×50 cm)，使其均匀沉降，用60%乙醇平衡柱床，凝胶柱床体积为230 mL。将1.3.2中的原花青素粗提液45℃真空浓缩至5 mL，用一次性吸管逐滴将样液缓慢加入到柱床表面，待样品完全渗入凝胶后，依次用体积分数60%乙醇、60%丙酮洗脱，流速1.0 mL/min，自动部分收集仪每5.3 min收集一管，每隔5管检测A500(原花青素的香草醛-盐酸法吸收峰)，绘制洗脱曲线。将两种流动相洗脱下来的组分分别收集，真空冷冻干燥得样品1和样品2。

1.3.4 原花青素的分析鉴定

1.3.4.1 可见分光光度分析

以试剂空白作参比，利用香草醛-HCl法［12］，每隔5管测定洗脱液吸光值，以洗脱体积/mL为横坐标，A500为纵坐标，绘制Sephadex LH－20洗脱曲线。

1.3.4.2 原花青素的含量测定

将真空冷冻干燥得到的样品1和样品2分别称重，计算得率。

样品得率=样品质量(mg)/2.0(g)

同时，用60%乙醇分别将样品1、样品2全部溶解，利用香草醛-HCL法［12］得出样品溶液中原花青素的浓度，从而计算出样品1、样品2的纯度。

纯度/%=［N×V×/样品质量(mg)］×100

式中:N，样品溶液中原花青素的浓度(mg/mL);V，样品溶液总体积(mL)。

1.3.4.3 紫外光谱分析［14］

将样品1溶液、样品2溶液和用60%乙醇溶解的原花青素标准品溶液，在200～400 nm内进行紫外光谱扫描，观察所得图谱在280 nm处是否有特征吸收峰。

1.3.4.4 花青素反应［15］

取适量原花青素标准品、样品1溶液、样品2溶液，利用正丁醇-盐酸法比色，观察溶液颜色变化，同时在500～700 nm内进行波段扫描，观察所得图谱在550 nm处是否有吸收峰。

1.3.4.5 油茶籽壳原花青素的HPLC分析

标样:7种儿茶素标准品，原花青素标准品。

HPLC色谱条件:Waters600泵，2489 Dual Absorbance Detector，LCsolution液相色谱工作站;色谱柱:大连Elite Hypersil ODS-C18柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm);流动相:A相为2%的色谱级醋酸水溶液，B相为乙腈;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;检测波长:280 nm;进样量:5 μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 油茶籽壳原花青素高效液相色谱梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 Sephadex LH－20洗脱特性

由图1可以看出，Sephadex LH－20分部洗脱分离原花青素组分，在A500处有2个大的洗脱峰，将其真空冷冻干燥，得样品1(39 mg)和样品2(24.2 mg)，然后对各分离组分进行检测分析。

图1 Sephadex LH－20动态洗脱曲线

2.2 原花青素含量测定

样品1得率=19.5 mg/g，纯度3.8%;样品2得率12.1mg/g，纯度57.3%。说明60%乙醇溶液洗脱部分的原花青素含量低，可能主要为单体儿茶素及其他水溶性成分［13］;而主要的原花青素部分由60%丙酮溶液洗脱下来，这表明60%丙酮洗脱原花青素的效果较好。

2.3 紫外光谱分析

原花青素标准品在280 nm处有最大吸收峰，由图2可知，样品2也在280 nm处有最大吸收，而样品1由于原花青素纯度低，与标准品溶液的光谱图略有偏差。

图2 样品和PC标准品的紫外扫描图谱

2.4 花青素反应

原花青素在酸性条件下加热生成最大吸收波长在550 nm附近的红色花青素，此法对原花青素具有专一选择性，也是一种测定原花青素含量的较好方法。

对样品1和样品2进行花青素反应，结果表明，样品1反应后显淡棕色，样品2和原花青素标准品均呈现红色。此外，从图3的扫描图谱中也可以看出，原花青素标准品进行花青素反应后，在550 nm处有最大吸收峰，样品2亦在550 nm处呈现特征吸收值，而样品1可能由于原花青素的含量较低，未呈现特征峰值。

图3 样品和PC标准品Porter反应后的扫描图谱

2.5 样品的HPLC分析

样品1、样品2溶液经HPLC检测，对所得色谱图与儿茶素混合标准品及原花青素标准品的色谱图进行比较分析。

由图4可知，儿茶素标准品的GA、C、EC、EGCG、ECG与原花青素标品组分的保留时间相同，结合文献报道［16］，可以推断原花青素标品含有 GA、C、EGCGG、ECG等儿茶素组分。

图4 七种儿茶素标品和原花青素标品的色谱图

从图5中可以看出，样品中的物质比较复杂，样品1、2与原花青素标品在GA、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ位置均有相同的保留时间;样品2与原花青素标品在ECG位置有相同的出峰时间;因此，可以推断油茶籽壳中可能存在原花青素的单体物质(GA、ECG等)。

图5 样品和原花青素标品的色谱图

3 结论

采用Sephadex LH－20凝胶柱纯化油茶籽壳原花青素粗品，使用60%的丙酮水溶液作为洗脱液洗脱效果较好，所洗脱出的原花青素含量达57.3%，远高于60%乙醇洗脱出的原花青素含量(3.8%)。

通过对样品进行光谱扫描和花青素反应，初步推断洗脱出的样品含有原花青素，高效液相色谱分析表明，从Sephadex LH－20洗脱下来的样品组分可能含有原花青素的单体物质(GA、ECG)。

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