北五味子多糖提取条件及其抗氧化性能

游玟娟，温拥军

(湖南化工职业技术学院，湖南株洲，412004)

五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill)为木兰科植物五味子干燥成熟果实，可分为北五味子和南五味子2种。五味子中含有挥发油、有机酸、维生素、木脂素、三萜、倍半萜及多糖等多种化学成分［1］。研究表明［2－5］，五味子多糖具有促进免疫、抗肿瘤、抗氧化和抗衰老等多种药理作用和功效。

超声波技术主要利用超声产生的“空化”效应，使细胞破裂，具有穿透力强，成本低，操作简便等特点［6］，因此近年来在天然产物成分提取领域被广泛应用。本文采用响应曲面法优化超声辅助乙醇提取北五味子多糖工艺条件，并对北五味子多糖抗氧化性能进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

北五味子，购于株洲市千金大药房。

葡萄糖，3，5-二硝基水杨酸，钨酸钠，酒石酸钾钠，NaOH，结晶酚，亚硫酸钠，乙醚，乙酸，石油醚，三氯甲烷等，均为分析纯

HH.SYH-Ni2-C水浴锅(北京长源实验设备厂)，DHG－9140A型干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);LDZ4－0.8A离心机(北京医用离心机厂)，UV－9100紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)，SB－5200超声波清洗器(上海新芝生物技术研究所)。

1.2 实验方法

1.2.1 北五味子干粉的制备

将北五味子洗净后，置于80℃烘箱中烘干后粉碎，过80目筛，备用。

1.2.2 北五味子多糖测定方法

相应的特征方程为根为r1=0.92，r2,3=-0.21±0.30i,由引理3,原差分方程的解即所求概率为

采用DNS法［7］进行测定。取1g北五味子干粉，按1∶25加入体积分数70%乙醇，置于功率设定为200 W的超声波清洗器中，在温度为60℃条件下提取40 min，小心倒出上清液，重新添加70%乙醇，重复提取5次，收集所有提取液，置于4 000 r/min离心机中离心10 min，取上清液适当稀释，按DNS法测540 nm处吸光值(A)。以吸光值对应的多糖量乘以稀释倍数，除以样品的质量，即得到北五味子总多糖。各实验条件下提取的多糖量按如下公式计算:

多糖量/(mg·g－1)(以葡萄糖计)=(c× D ×V/m)×0.9

式中:c为被测液A值所对应标准曲线中葡萄糖浓度(mg/mL);D为稀释倍数;V为样品液总体积(mL);m为投加的五味子干粉质量(g)。

1.2.3 北五味子多糖提取条件优化方法

单因素实验提取剂选用乙醇、乙酸、石油醚、氯仿、水5个水平;乙醇体积分数采用 30%、40%、50%、60%、70%5 个水平;提取温度为 40、50、60、70、80℃5 个水平;提取料液比(g∶mL)采用 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 五个水平;提取时间采用 30、40、50、60、70 min 5个水平。在单因素实验基础上，选择对提取率影响显著的3个因素，运用Box-Behnken实验设计进行3因素3水平响应面优化。

1.2.4 北五味子多糖抗氧化性能测定方法

分别测定北五味子多糖提取液对·OH、O－2·清除效果，评价其抗氧化性能。·OH自由基清除率采用贾之慎［7］等Fenton体系比色法进行测定·清除率采用宋慧［8］等实验方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线绘制及总多糖含量测定结果

以葡萄糖浓度为为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线见图1，回归方程为:y=0.403 9x－0.006 4，R2=0.998 8，式中 x为葡萄糖浓度(mg/mL)，y为吸光值。在0～1.2 mg/mL内葡萄糖含量与吸光值呈良好线性关系。测得北五味子中总多糖含量为153.2 mg/g。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 单因素实验结果

2.2.1 提取剂对北五味子多糖提取率的影响

取1 g北五味子干粉5份，分别按1∶20(g∶mL)加入50%乙醇、30%乙酸、石油醚、三氯甲烷、水，在超声波功率为200 W，温度为60℃条件下提取40 min，提取2次，合并提取液。提取液于4 000 r/min离心机中离心15 min，取1 mL上清液加入提取剂9 mL，混匀，再以提取剂为空白，按DNS法测540 nm处的吸光值。吸光值对应葡萄糖含量乘以稀释倍数，除以北五味子干粉的质量，再除以总多糖，得到相对提取率。测得结果见图2。

图2 不同提取剂对北五味子多糖提取的影响

由图2可知，用乙醇和水为提取剂的提取率较高，其中乙醇的相对提取率78.3%，且由于乙醇沸点低，便于后续浓缩分离工艺，宜选乙醇作为提取剂。

2.2.2 乙醇浓度对北五味子多糖提取率的影响

分别采用30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，按2.2.1方法提取，测相对提取率，结果见图3。

图3 乙醇浓度对北五味子多糖提取的影响

图3结果显示，30%～70%的乙醇对北五味子多糖的提取能力是先增大后减小。乙醇体积分数为60%时的相对提取率达到82.2%，继续增大浓度则提取效果反而下降，原因是乙醇浓度过高会使细胞膜发生变性，阻止后续乙醇分子进入细胞;而且乙醇浓度过高，会影响多糖的溶解度，导致在离心过程中，多糖成分随残渣被分离掉，从而影响提取效果。故乙醇溶液宜选60%。

2.2.3 料液比对北五味子多糖提取率的影响

固定超声波功率为 200 W，分别以 1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35(g∶mL)的料液比加入浓度为 60%的乙醇，在60℃下提取40 min，所得结果见图4。料液比与提取率成反比，当料液比为1∶25时，多糖相对提取率达到86.4%，再降低料液比提取率增加不显著。而低料液比会造成乙醇浪费和后续浓缩的困难。故料液比宜选适1∶25。

图4 料液比对北五味子多糖提取的影响

2.2.4 提取温度对北五味子多糖提取率的影响

固定超声波功率为200 W，料液比为1∶25，温度分别设为 40、50、60、70、80℃，提取 40 min，所得结果见图5。结果表明适宜的温度能够得到较高的提取率，温度过高会增加能耗并造成溶剂因蒸发而损失，使提取率下降。因此，提取温度宜选60℃。

图5 温度对北五味子多糖提取的影响

2.2.5 提取时间对北五味子多糖提取率的影响

固定超声波功率为200 W，料液比为1∶25，温度为60℃，提取时间分别设为 30、40、50、60、70 min 进行提取，所得结果见图6。结果表明，提取时间越长，则相对提取率越高，一般认为，提取率在90%左右时，在经济上较为合适［9］。因此，提取时间选择为40 min。

图6 时间对北五味子多糖提取的影响

2.3 BBD实验设计及结果

通过单因素实验，确定了对北五味子多糖提取率影响显著的3个因素，即提取剂浓度(X1)、料液比(X2)、提取温度(X3)。运用Box-Behnken实验设计对提取条件进一步优化，利用Minitab软件设计一个3因素3水平共15个试验点的试验设计，所得结果如表1所示。

以北五味子多糖相对提取率为响应值，用Minitab15.0软件对表1所得数据进行多元回归分析，X2、以及交互项对响应值影响显著，X、1对响应值影响不显著，得到X对响应值Y的影响可用回归方程为:北五味子多糖提取率Y=86.63－2.54 X2－3.03 X3－5.03－7.60－2.43 X1X2+6.35 X2X3，决定系数R2为97.68%。方差分析结果表明，模型在α=0.01水平上回归显著，失拟不显著，因此模型选择正确，可用该方程代替真实试验点对提取率进行分析和预测。求解得到最佳条件为:X1=－0.53，X2=0，X3=－0.2，换算得到各因素的实际水平分别为∶乙醇浓度X1=54.7%、料液比X2=1∶25=58℃，模型预测结果为86.93%，验证实验五味子多糖相对提取率为87.12%(n=3)。根据回归方程绘制的响应面和等高线分析图见图7～图9。响应面可以直接反应各因子对响应值影响的大小，由等高线图可得到最优条件下各因子的取值［10］。

表1 Box-Behnken实验设计及结果

图7 Y=f(X1，X2)响应面立体分析图和相应等高图

图8 Y=f(X2，X3)响应面立体分析图和相应等高图

图9 Y=f(X1，X3)响应面立体分析图和相应等高图

图7显示，乙醇浓度与料液比交互作用显著而且复杂，在高料液比、高乙醇浓度的较小区域内，可得到较高的提取率;固定提取温度为60℃时，当乙醇体积分数为68.2%时，料液比为1∶23.3时，相对提取率可达89.00%。图8显示，固定乙醇体积分数60%时，料液比与提取温度的关系，当提取温度为57.1℃，料液比为1∶23时，提取率可达87.81%。图9显示，固定料液比为1∶25时，乙醇浓度与提取温度的交互作用显著，在相对较低温度、高乙醇浓度的范围内，可获得较高的提取率;当提取温度为57.6℃，乙醇体积分数为68.9%时，预测提取率可达88.79%。

2.4 北五味子多糖对·OH、·清除率测定结果

3 结论

图10 北五味子多糖对·OH、·清除能力

本文采用单因素结合响应曲面法对超声辅助乙醇提取条件进行了研究，并考察了北五味子多糖的抗氧化性能。结果表明，乙醇浓度，温度，料液比对北五味子多糖提取率有显著影响，采用Box-Behnken实验设计建立了关键影响北五味子多糖提取率的二次多项式:北五味子多糖提取率Y=86.63－2.54 X2－3.03 X3－5.03－7.60－2.43X1X2+6.35 X2X3，得到最佳提取条件为:乙醇浓度X1=54.7%、料液比X2=1∶25、提取温度X3=58℃;其他条件为:超声功率200 W，提取时间40 min，提取次数2次，在此条件下，北五味子多糖相对提取率为87.12%(n=3)，优于传统的水提法和醇提法。北五味子多糖具有较强的抗氧化性能，当浓度为1.2 mg/mL时，·OH、清除率分别为66.7%、44.5%。

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