酒精处理对青春期大鼠海马齿状回BDNF和trkB的影响

王建中

（河南省漯河医学高等专科学校，漯河 462002）

酒精处理对青春期大鼠海马齿状回BDNF和trkB的影响

王建中

（河南省漯河医学高等专科学校，漯河 462002）

目的 为探讨青春期饮酒致学习记忆力下降并长期持续的可能机制，本研究观察了青春期大鼠酒精处理后海马齿状回BDNF（脑源性神经营养因子）和trkB（酪氨酸激酶受体B）的含量变化。方法 选用30d（天）龄SD雄性大鼠，以25%法）检测海马齿状回BDNF和trkB的含量，Motic3.2图像分析系统测定免疫阳性产物的平均灰度值。结果 BDNF和trkB的含量在停酒后0d、3d、7d，实验组与相应对照组相比均无显著差异 （P＞0.05）；停酒后14d，BDNF含量显著上升 （P＜0.05），trkB含量显著下降 （P＜0.05）。结论 BDNF、trkB含量的相对不足致齿状回神经再生能力下降，可能是青春期饮酒致学习记忆力持续性下降的原因之一。

青春期大鼠；酒精；海马齿状回；BDNF；trkB

过度饮酒可明显影响人类的学习记忆，青春期更是如此。动物实验表明［1］，酒精处理的青春期大鼠出现明显的学习记忆损害，且停酒后这种损害会持续存在；而经同样酒精处理的成年鼠在停酒后的相同时间，酒精对其学习记忆的损害基本消除。这一实验提示青春期饮酒对学习记忆能力的损害是长期的，比成年期饮酒的损害要大。海马是哺乳类动物完成学习记忆的关键结构，其齿状回的神经发生是学习记忆的机制之一。酒精对记忆的影响是由于其对海马的特异损害造成的。BDNF是脑组织中含量最丰富的神经生长因子，其功能是与其高亲和性受体trkB结合后，经胞内的一系列信号转导途径，促进神经再生、细胞存活而抑制其凋亡，进而促进学习记忆功能。BDNF、trkB及其mRNA在正常海马均有分布且含量较高。本实验是通过观察青春期大鼠酒精处理后海马齿状回BDNF和trkB受体的含量，初步探讨青春期摄入酒精致学习记忆力下降并长期持续的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 30d龄雄性SD大鼠48只；兔抗BDNF和trkB抗体，生物素化羊抗兔IgG、ABC（卵白素－生物素－辣根过氧化物酶复合物）液及DAB（二氨基联苯胺）液。

1.2 动物分组与建模 将大鼠随机分为实验组与对照组，实验组又分为停酒后0d、3d、7d和14d组，对照组也相应分为4组？实验组以25% （V／V，用生理盐水配制）酒精按20.25ml／kg体重／次 （即纯酒精4g／kg体重／次）灌胃，每天早晚各灌一次，中间间隔12h，连续灌胃7d，动物分别在停酒后0d、3d、7d和14d处死；对照组以等量生理盐水代替酒精按同样方法处理。

1.3 BDNF和trkB免疫组织化学染色 各实验组及相应对照组分别在停酒后0d、3d、7d和14d用10%水合氯醛深度麻醉，打开胸腔及心包腔，自心尖经左心室将穿刺针刺入升主动脉，剪开右心耳，先快速灌注生理盐水200ml，后灌注4%多聚甲醛300ml，取脑并以4%多聚甲醛后固定2h，30%蔗糖 （pH7.4的0.01mol／L磷酸盐缓冲液为溶剂）浸泡直至脑组织沉底，取含海马的脑组织行冰冻切片，片厚25μm，每隔3张取1张切片，切片收集于0.01M PBS（磷酸盐缓冲液）中切片经3%H2O2（0.01MPBS为溶剂）溶液处理30min，以灭活内源性过氧化物酶。5%正常牛血清白蛋白 （含0.1%Triton X－100）室温封闭2h；切片依次入兔抗BDNF和兔抗trkB（均为1∶1000）抗体，先室温孵育2h，后4℃过夜；生物素化羊抗兔IgG（1∶200）室温孵育2h；ABC液 （1∶200）室温孵育2h；含0.05%DAB和0.01%H2O2显色液中显色6～8min，显微镜下控制反应？上述各步骤间均以0.01MPBS漂洗5min／次×3次。裱片，室温干燥后梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

对照实验用正常牛血清白蛋白替代一抗，其余步骤相同，结果为阴性。

1.4 图像分析及统计方法 在Nikon H600L显微镜下观察海马齿状回免疫反应结果并摄像。用Motic3.2图像分析系统测定免疫反应阳性产物的平均灰度值，每组每张切片在其海马齿状回的上、中及下部各选取1个视野，取平均值。用SPSS17.0统计软件分析，样本均数比较用t检验。

2 结果

BDNF和trkB免疫阳性产物在海马齿状回均主要分布于颗粒细胞层。停酒后0d、3d、7d组与相应对照组相比，BDNF和trkB含量均无显著差异 （P＞0.05）；停酒后14d组与相应对照组相比，BDNF含量明显上升（P＜0.05，见表1），trkB含量明显下降 （P＜0.05，见表2）。

表1 各组大鼠海马齿状回BDNF免疫组化检测结果（平均灰度值，±S）

表1 各组大鼠海马齿状回BDNF免疫组化检测结果（平均灰度值，±S）

注：＊，与相应对照组比较P＜0.05；各组样本含量均为n＝6；平均灰度值与免疫阳性产物含量成反比

实验组 对照组131.15±5.05 0d 150.21±20.44 182.10±2.57 3d 155.61±29.81 149.29±2.40 7d 162.48±28.69 132.68±4.86 14d 112.75±9.33＊

表2 各组大鼠海马齿状回trkB免疫组化检测结果 （平均灰度值，±S）

表2 各组大鼠海马齿状回trkB免疫组化检测结果 （平均灰度值，±S）

注：＊，与相应对照组比较P＜0.05；各组样本含量均为n＝6；平均灰度值与免疫阳性产物含量成反比

实验组 对照组96.74±10.28 0d 149.92±14.18 154.61±9.24 3d 137.27±7.52 130.17±15.27 7d 124.13±11.85 134.97±24.82 14d 128.80±11.97＊

3 讨论

在海马齿状回，颗粒细胞作为主要的功能神经元在学习记忆中发挥着重要作用。齿状回终生保持了生成新神经元的能力，颗粒细胞下层的新生细胞部分迁移到颗粒细胞层，分化为颗粒细胞，产生树突、轴突，形成突触联系，整合到海马功能的神经环路中。颗粒细胞层的新生细胞与记忆的形成密切相关［2］。颗粒细胞再生能力与年龄具有明显的相关性，年龄越小再生能力越强，随着年龄的增加，神经发生渐弱［3］，且新生细胞生理功能明显下降［4］。海马中BDNF表达的修饰是影响神经发生的一部分机制，BDNF在神经元的存活、诱导和分化中不可或缺［5］。齿状回神经发生过程极易受到个体所处外界环境和病理因素的影响，使海马区结构具有极大的适应性和可塑性［6］。酒精会引起神经细胞发生程序性凋亡且频率增加，神经再生无法及时弥补缺失神经元的功能，最终导致学习记忆力下降。研究发现，孕期酒精暴露后，仔鼠齿状回细胞的数量明显减少甚至凋亡，进而引起学习记忆力下降［7］。孕期酒精暴露引起神经元凋亡对出生后发育过程的影响是长期持续性的［8］。

本实验中，齿状回颗粒细胞的BDNF和trkB在停酒后0d、3d、7d均没有显著变化 （P＞0.05），可能是因为酒精处理后的青春期鼠比成年鼠更易耐受酒精的影响。停酒后14d，BDNF的含量虽明显上升 （P＜0.05），但其受体trkB的含量却显著下降 （P＜0.05），使BDNF经trkB促神经发生的功能下降，而青春期个体齿状回神经发生较为活跃且易受外界影响；同时，酒精引起神经元凋亡且此影响可能将长期持续。故BDNF含量相对不足，从而使其促神经发生的能力下降，同时酒精引起神经元凋亡且影响持续存在，这些均可能是青春期饮酒致学习记忆力持续性下降的原因。

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10.3969／j.issn.1672-2779.2013.11.097

1672-2779（2013）-11-0147-02

（本文校对：张文娟

2013-05-18）