猪肺炎支原体S C株P 4 6基因的定点突变

邱文英，郝伟伟，徐 静，方鹏飞，张 洪，向丕元

（四川省华派生物制药有限公司，四川 简阳 641400）

猪喘气病，又名猪地方性肺炎，是由猪肺炎支原体引起的慢性接触性呼吸道疾病。猪肺炎支原体感染猪后将引起猪的肺部损伤，使之表现出咳嗽和气喘等症状。猪肺炎支原体和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）共同感染时，由于PRRSV可以造成猪的免疫抑制，因而加剧肺部症状，使疾病进一步恶化。

猪肺炎支原体P46基因全长为1260bp，编码419个氨基酸（46kD）。编码的P46蛋白是猪肺炎支原体的表面抗原，可引起机体对猪肺炎支原体的早期免疫反应。P46基因序列中有3个编码Trp的密码子TGA，而在大肠杆菌表达系统中TGA为终止子，因此要使P46基因在大肠杆菌中顺利地表达有两种方法：一是将编码Trp的密码子TGA突变为TGG；二是构建通读TGA的表达系统。由于构建通读TGA的表达系统较困难且表达量较低，而定点突变法更为简单，因此定点突变方法被更多人采用。

本文通过重叠延伸PCR法（SOE-PCR）将P46基因中的3个密码子TGA定点突变为TGG，从而使P46基因能在大肠杆菌中顺利地进行表达，为P46重组蛋白的获得及猪肺炎支原体的诊断检测奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 质粒 含猪肺炎支原体SC株P46基因的pEasy-P46质粒由四川省华派生物制药有限公司克隆及保存。

1.2 试剂 PCR Master Mixture、小量DNA回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，DNA Marker、pEasy-T载体购自北京全式金生物技术有限公司。其余试剂均为分析纯。

1.3 定点突变引物设计 根据猪肺炎支原体SC株P46测序结果及重叠延伸PCR原理，设计1对全长引物及3对突变引物用于将TGA定点突变为TGG。引物序列见表1。

表1 P46基因全长引物及突变引物序列

1.4 SOE-PCR定点突变 采用SOE-PCR法进行定点突变的操作过程（见图1）如下：首先以pEasy-P46质粒为模板，分别以F1和RB，FB和R1两对引物扩增得到2段PCR产物D和E，D、E经切胶纯化后作为模板，以F1和R1为引物扩增得到B位点已突变的P46基因；再以B位点已突变的P46基因为模板，以F1和RA，FA和RC，FC和R1为引物扩增得到3段PCR产物F、G、H，并将PCR进行切胶纯化；以纯化后的F、G作为模板，以F1和RC为引物扩增得到PCR产物I并进行切胶纯化；以纯化后的I、H为模板，以F1和R1为引物扩增即可得到A、B、C 3个位点均突变的P46基因。

图1 重叠延伸PCR定点突变示意图

1.5 克隆及测序 将SOE-PCR产物进行切胶纯化后与pEasy-T载体连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，根据《分子克隆实验指南》进行阳性克隆菌落的筛选，挑取白斑进行PCR鉴定。将鉴定为阳性的质粒送往上海英潍捷基生物技术有限公司测序，经测序鉴定的阳性质粒命名为pEasy-P46m。

2 结果

图2 PCR产物D、E琼脂糖凝胶电泳

图3 PCR产物F、G和H琼脂糖凝胶电泳

图4 PCR产物I琼脂糖凝胶电泳

2.1 SOE-PCR定点突变 在使用重叠延伸PCR对3个TGA密码子进行突变的过程中共进行了8次PCR，其产物D、E片段大小分别为303bp和957bp，产物F、G、H片段大小分别为210bp、552bp和498bp，产物I片段大小为752bp。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（见图2、3、4），结果表明这些片段大小与预期结果相符。

2.2 克隆及测序 重叠延伸PCR进行定点突变后，将突变的P46基因克隆至T载体中并测序。测序结果表明，P46基因中原有的3个TGA密码子成功地突变为TGG（见图5、6、7）。

图5 A处碱基A定点突变为G

图6 B处碱基A定点突变为G

图7 C处碱基A突变为G

3 讨论

1989年，Horton等成功建立了重叠延伸PCR（SOEPCR）法，并应用此技术成功构建了一种杂交基因。利用SOE-PCR不仅能对基因进行定点突变，还实现了大片段的插入及删除。本研究利用SOE-PCR对猪肺炎支原体SC株的P46基因进行了定点突变，使其中3个编码Trp的密码子TGA定点突变为TGG。

早前就有利用SOE-PCR对猪肺炎支原体P46基因进行定点突变的报道。利用SOE-PCR进行P46基因定点突变的过程中，多采用突变引物分段扩增后再顺次连接的方法。由于在分段扩增过程中，第2扩增片段小于100bp，就使得PCR产物的纯化及回收存在一定的难度。本研究先进行了B位点的定点突变，获得B位点已突变的P46基因后，再进行A位点和C位点的定点突变，这就可以避免由于小片段PCR产物纯化所造成的困难。

用猪肺炎支原体表面膜蛋白P46检测抗原时具有很好的特异性和敏感性，由此基于P46蛋白的血清学检测方法可以用于对猪肺炎支原体的特异性检测。本研究成功地对P46基因进行了定点突变，使P46基因可以在大肠杆菌表达系统中进行表达，为P46重组蛋白的表达及猪肺炎支原体的检测诊断奠定了基础。

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