曲美他嗪后处理与缺血后处理对大鼠再灌注心肌保护作用的对比

阮圣斐 周大亮 赵学忠 睢大员 于小风 曲绍春 江一川

(吉林大学第一医院心血管疾病诊治中心，吉林 长春 130021)

心肌缺血再灌注损伤是在各种原因导致心肌血液灌注量减少引起心肌缺血性损伤的基础上，恢复血流后缺血性损伤进一步加重，甚至出现不可逆性损伤的现象。2003年，Zhao等〔1〕提出缺血后处理的概念后，大量的临床实验已经证实后处理可减轻再灌注损伤〔2〕。近年来人们发现在心肌再灌注开始时应用某些药物进行后处理也可以实现相似的效果〔3〕。本实验尝试应用曲美他嗪(TMZ)进行药物后处理，并对比观察曲美他嗪后处理和缺血后处理对心肌的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性、清洁Wistar大鼠40只，体重230～270 g，合格证号:SCXK-(吉)2003-0001，购自吉林大学动物实验中心。

1.2 试剂及仪器 BX51光学显微镜(日本 Olympus);JEM-1200EX型透射电子显微镜(日本);RM-2145型石蜡切片机(徕卡公司);DR-HW-1电热恒温水温箱(北京西城区医疗器械厂);COBAS-FARA自动生化分析仪(瑞士Roche公司);曲美他嗪片剂(法国施维雅公司)。

1.3 实验分组及给药 将40只Wistar大鼠按体重随机分为假手术组、模型组、曲美他嗪组、缺血后处理组。假手术组只开胸心脏穿针但不结扎;心肌缺血再灌注模型参照文献〔4〕方法稍加改进，开胸结扎前降支，造成缺血30 min后，松开丝线恢复冠状动脉血流，再灌注120 min;曲美他嗪组于再灌注前60 min灌胃曲美他嗪10 mg/kg，使再灌注时血药浓度达峰值;缺血后处理组缺血30 min后解开丝线再灌注30 s、再结扎30 s，循环3次后持续再灌注120 min。

1.4 梗死面积测量 每组取5只大鼠取血后剖取心脏，用生理盐水洗净心腔内积血，去掉心房组织及脂肪，称重，将左心室心肌横切4～5片，然后浸入氯化硝基四氮唑蓝(NB-T)磷酸缓冲液中，置37℃恒温水浴，待染色完全后取出，正常组织染色，缺血组织不染色。切下缺血心肌称重，用缺血心肌与左心室湿重的百分比计算梗死面积。

1.5 心肌细胞形态学观察 其余5只大鼠取血后剖取心脏，取心尖相应心肌组织制备成1 mm3标本，置入2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定液中，备电镜采集图像。同时将余下左心室环切块，10%中性甲醛缓冲液中固定，备HE染色、镜检并采集组织图像。

1.6 血清心肌酶测定 各大鼠自腹主动脉取血2～3 ml置于离心管，静置 30 min，离心12 min(4℃，3 000 r/min)，取上清液以COBAS-FARA自动生化分析仪检测血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)活性。

1.7 统计学处理 实验数据以x±s表示，采用组间比较t检验进行统计分析。

2 结果

2.1 曲美他嗪后处理对心肌梗死面积的影响 假手术组未见缺血及梗死区，曲美他嗪组〔(12.73±2.0)%〕与缺血后处理组〔(11.76±3.1)%〕差异无统计学意义(P＞0.05)，两组与模型组〔(18.42±4.1)%〕比较差异显著(P＜0.05)。

2.2 曲美他嗪对心肌组织形态学的影响 HE染色光镜下显示:假手术组心肌细胞大小、结构正常，排列规则，细胞界限清晰;模型组心肌细胞肿胀，界限不清，间隙增大，心肌纤维间充满大量红细胞或中性粒细胞浸润;曲美他嗪组与缺血后处理组的形态变化较模型组均有不同程度改善。见图1。

2.3 曲美他嗪后处理对心肌细胞超微结构的影响 假手术组心肌细胞超微结构基本正常，其余各组均有不同程度损伤，以模型组损伤最为严重，曲美他嗪后处理及缺血后处理组损伤较轻。见图2。

2.4 曲美他嗪后处理对心肌酶学的影响 与模型组相比，曲美他嗪组和缺血后处理组CK、LDH、AST活性均明显降低(P＜0.05)，曲美他嗪组与缺血后处理组之间差异不显著(P＞0.05)。见表1。

图1 各组心肌组织形态学改变(HE，×100)

图2 各组心肌组织超微结构(×25 k)

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤的概念1960年首次由Jennings等〔5〕提出，半个世纪以来，伴随着临床上PTCA、PCI、CABG等治疗技术的广泛应用，其危害越来越受到人们的关注。Zhao等〔1〕在结扎犬左冠状动脉前降支60 min后，给予重复3次的30 s再灌/30 s缺血的循环，然后再恢复冠脉血流，观测到心肌梗死面积减小，从而提出了缺血后处理的方案;随后，大量的临床实验已经证实这种经典的后处理方法有明确的心脏保护作用〔2〕。故本实验中采用这种经典的后处理方式建立缺血后处理组的模型。

近年来随着对后处理研究的增多，人们逐渐尝试在心肌再灌注开始时应用某些药物以模拟后处理机制，并取得了相同或相似的心肌保护作用〔3〕。曲美他嗪是欧洲心脏学会专家组建议中惟一提到具有潜在的抗心绞痛的代谢药物，也是目前惟一经临床多中心研究证实有抗心绞痛作用的代谢药物，故本实验尝试应用曲美他嗪进行药物后处理，观察其是否对再灌注心肌具有保护作用。

实验结果显示应用曲美他嗪进行后处理后，相对于再灌注模型组，可使大鼠心肌梗死面积减少，血清AST、LDH、CK活性不同程度的降低，心肌组织形态损伤有较大程度的减轻，心肌细胞超微结构损伤也有较大程度的减轻，其效果与经典的缺血后处理效果相当，显示曲美他嗪后处理同样可以减轻心肌的再灌注损伤。

再灌注损伤的发生机制目前认为主要是自由基增多和钙超载所引起〔6〕。自由基增多可以使线粒体膜发生脂质过氧化，使线粒体结构和功能受损，并破坏膜上离子转运蛋白〔7〕;钙超载则可以促进自由基生成，并且能加重细胞内酸中毒，还可以激活多种磷脂酶，破坏细胞内膜结构。而TMZ可选择性抑制线粒体酶-长链3-酮酰辅酶A硫解酶(KAT)〔8〕，直接抑制细胞内耗氧过多的脂肪酸β-氧化途径，间接增加葡萄糖氧化分解，从而利用有限的氧，维持 ATP的产生，保证心脏的收缩功能〔9〕;并且可以提高自由基清除酶活性，抑制氧自由基对膜脂质过氧化反应，稳定细胞内的各种膜结构，减少细胞内酶的漏出〔10〕;同时还能减轻线粒体内钙聚积，抑制Ca2+积聚引起的线粒体肿胀，维持线粒体功能〔11〕。在本次实验中，通过光镜及电镜的观察，显示TMZ后处理通过上述可能的机制减轻了细胞结构损伤，尤其是线粒体结构的损伤，使濒死心肌细胞得以存活，最终减小了心肌梗死面积，降低了心肌酶的释放。临床上随着介入治疗的广泛开展，使得开通冠脉的同时进行曲美他嗪后处理成为可能，且简便易行，值得进一步推广。但此种方式仍需更多动物实验以及临床实验的研究证实其可靠性和安全性。

1 Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003;285(2):H579-88.

2 Watanabe T，Niwa K，Niinuma H.Efficacy of postconditioning combined thrombus aspiration in patients with st-segment elevation myocardial infarction〔J〕.JAm College Cardiol，2012;59(13):E471-1.

3 Burley DS，Baxter GF.Pharmacological targets revealed by myocardial postconditioning〔J〕.Curr Opin Pharmacol，2009;9(2):177-88.

4 睢大员，曲绍春，于小风，等.雷米普利对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及机制探讨〔J〕.中国实验诊断学，2009;13(11):1501-3.

5 Jennings RB，Sommers HM，Smyth GA，et al.Myocardial necrosis induced by temporary occlusion of a coronary artery in the dog〔J〕.Arch Pathol，1960;70:68-78.

6 Piper HM，Abdallah Y，Schafer C.The first minutes of reperfusion:a window of opportunity for cardioprotection〔J〕.Cardiovasc Res，2004;61(3):365-71.

7 Garciarena CD，Fantinelli JC，Caldiz CI，et al.Myocardial reperfusion injury:reactive oxygen species vs.NHE-1 reactivation〔J〕.Cell Physiol Biochem，2011;27(1):13-22.

8 Kantor PF，Lucien A，Kozak R，et al.The antianginal drug trimetazidine shifts cardiac energy metabolism from fatty acid oxidation to glucose oxidation by inhibiting mitochondrial long-chain 3-ketoacyl coenzyme A thiolase〔J〕.Circ Res，2000;86(5):580-8.

9 Stanley WC，Marzilli M.Metabolic therapy in the treatment of ischaemic heart disease:the pharmacology of trimetazidine〔J〕.Fundam Clin Pharmacol，2003;17(2):133-45.

10 Wisel S，Khan M，Kuppusamy ML，et al.Pharmacological preconditioning of mesenchymal stem cells with trimetazidine protects hypoxic cells against oxidative stress and enhances recovery of myocardial function in infarcted heart through Bcl-2 expression〔J〕.J Pharmacol Exp Therap，2009;329(2):543-50.

11 Morillas Blasco PJ，Hernandiz Martinez A，Azorin Villena I，et al.Mitochondrial changes induced by trimetazidine in the myocardium〔J〕.Med Sci Monit，2005;11(6):BR162-7.