稻曲病菌厚垣孢子中cAMP提取条件优选

李 媛，任佐华，刘敏捷，杨 浪，陈娟芳，刘二明*

(1.湖南农业大学生物安全科学技术学院，湖南长沙 410128;2.湖南农业大学信息科学技术学院，湖南长沙 410128;3.湖南农业大学东方科技学院，湖南长沙 410128)

水稻稻曲病是由稻绿核菌(Ustilaginoidea virens(Cooke.)Takahashi)引起的水稻穗部病害［1］。20世纪80年代以来，由于杂交水稻和籼粳杂交育成的高产品种的推广，分蘖期和孕穗期追施氮肥等多种原因导致稻曲病的发生日趋严重［2］。在稻曲病菌侵染循环中，厚垣孢子是重要的初侵染源［3］。稻曲病菌厚垣孢子，具有休眠期长、基数大等特点，是稻曲病菌越冬的主要病原体［4］。环磷酸腺苷(cAMP)是一种核苷酸衍生物，与信号转导以及细胞的各种生理病理现象密切相关，是生物体内重要的第二信使［5］。有研究发现，cAMP也参与植物致病性真菌生长发育、调控其致病性，并且调控无性孢子的萌发［6］。稻曲病菌在引起穗粒发病过程中，其病征表现由黄色转变成黑色粉(厚垣孢子)状，即由非休眠(黄色)转变成休眠(黑色)厚垣孢子，cAMP在这两种类型厚垣孢子中的转换和它们的萌发过程中有何作用，这对探究真菌的孢子休眠机制可能有重要价值。由于目前尚未有提取稻曲病菌厚垣孢子中cAMP研究方法的报道，因此，本研究以超声-水浴法为基础，探究提取稻曲病菌厚垣孢子cAMP的最适条件，为进一步的研究cAMP功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 稻曲病菌厚垣孢子 于2011年9月从常德市汉寿县军山铺镇的发病水稻(皖稻153)田间采集典型黄色、黄绿色、黑色稻曲球，用刀片将不同颜色稻曲球上的厚垣孢子小心刮下，并存放于－40℃冰箱中备用。

1.1.2 试剂 cAMP标准品(Sigma公司);甲醇(色谱纯Tedia公司);KH2PO4(国药集团上海化学试剂公司);CHCl3(国药集团化学试剂有限公司);正丁醇(国药集团化学试剂有限公司)。

1.1.2 仪器设备 高效液相色谱仪(岛津SPD-20A);超声波振荡器(JY92-Ⅱ型);电热恒温水浴锅(HSY2-SP);旋片式真空泵(ZXZ-1型);高速冷冻离心机(22331 hamburg)。

1.2 方法

1.2.1 样品中cAMP的提取［7］取适量的厚垣孢子粉末，用液氮研磨均匀后［8］，置于真空干燥箱中70℃干燥，由于黄绿色厚垣孢子为黄色与黑色厚垣孢子的过渡态，其结构与二者都比较相近，故以黄绿色厚垣孢子为主要提取材料，称取稻曲病菌黄绿色厚垣孢子粉1.0g，加入适量超纯水，超声5～15 min(功率400 W，间歇时间2 s)后，放置于圆底烧瓶中水浴2 h，冷却后，8 000 r/min离心10 min，去除孢壁等物质沉淀，取滤液定容100 mL。进样前，用Sevag法［9］脱蛋白法脱蛋白，将1 mL样品溶液加入到2 mL的小离心管中，加入氯仿-正丁醇(预先配制成体积比为4∶1混合液)溶液0.25 mL，置于2 mL新离心管中，充分振摇30 min后，以12 000 r/min离心5 min，然后将水相与氯仿相分开，取水相到一个新的离心管。

1.2.2 cAMP标准溶液的制备［10］精确称取10 mg cAMP标准品，以超纯水为溶剂，定容于50 mL容量瓶中，制备成 200 μg/mL cAMP标准液，备用。

1.2.3 色谱条件选择［10］根据文献中所提色谱条件，选取甲醇和磷酸二氢钾为流动相，通过V(甲醇)∶V(0.05 mol/L KH2PO4)不同比例10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70 的选择，以及流动相以1.2、1.0、0.8 mL/min 的不同流速选择，获得最佳色谱条件。

1.2.4 cAMP 含量测定［10］①cAMP 的标准曲线制作:分别精确量取1.2.2中的标准溶液1、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05 mL 标准液，置于 10 mL 容量瓶中定容成 20、10、8、6、4、2、1 μg/mL 的浓度梯度。将配置好的不同浓度标准液，各取1 mL溶液，都在12 000 r/min离心5 min，取上清液，过0.22 μm水膜，去除样品中可能给输液泵和柱子造成损伤的杂质后，将滤液以20 μL进样，在波长254 nm处进行HPLC测定。绘制cAMP标准曲线图，建立Y=aX+b回归方程(Y为峰值面积，X为cAMP浓度，a为回归系数，b为常数);②样品的cAMP测定:以1.2.1中的方法处理样品后，取1 mL提取液12 000 r/min离心5 min，取上清液，过0.22 μm 水膜，将滤液以 20 μL 进样，在波长254 nm处进行HPLC测定。

1.2.5 统计分析 根据以超声破碎时间、水浴温度和物料比3因素，及DPS数据处理系统［11］作3因素3水平设计(表1)。以后黄色、黑色厚垣孢子cAMP的提取用该设计优选的条件。

表1 3因素3水平提取厚垣孢子中cAMP的正交设计Table 1 The orthogonal test of the 3 factors and 3 levels for cAMP extraccted from chlamydospores

2 结果与分析

2.1 色谱条件确定

选择色谱柱为Athena C18-WP柱(4.6 mm×250 mm);流动相为 V(甲醇):V(0.05 mol/L KH2PO4)=20∶80;流速为 0.8 mL/min;检测波长为254 nm，进样量为20 μL。根据所选条件，得到样品出峰图(图1、2)，显示在该条件下样品出峰分离效果良好。

图1 cAMP标准品的HPLC图谱Fig.1 Chromatogrem of standard cAMP

图2 稻曲病菌厚垣孢子中cAMP的HPLC图谱Fig.2 Chromatogrem of cAMP determination in the U.virens of chlamydospores

2.2 标准曲线

根据 1.2.4的标准曲线制作方法，通过HPLC检测，浓度在1～20 μg/mL内色谱峰的面积与样品浓度呈线性关系，根据所得数据绘制标准曲线，并进行数据处理，获得标准曲线(图3)，并得回归方程为:Y=69 760X+277.60(式中:Y为标准溶液质量浓度，单位μg/mL;X为峰面积，单位mV)，相关系数R2=0.999 8。表明Y与X呈极显著正相关。

图3 cAMP含量标准曲线Fig.3 Standard curve of cAMP content

2.3 cAMP提取条件优化

表2 正交试验中测得厚垣孢子cAMP含量Table 2 Relatively cAMP contents of the chlamydospore in orthogonal experiment

采用超声-水浴结合的方式，进行3因素3水平的正交试验(表1)，得到结果如表2、3。根据R及P值的大小可知各因素对cAMP提取影响为:A＞C＞B，说明超声时间对cAMP提取影响最大，其次为物料比率，最小的是水浴温度，最佳的提取条件为A2B2C3。即超声破碎时间10 min，水浴温度80℃，物料比为1∶100。

表3 厚垣孢子中cAMP含量的正交设计方差分析表Table 3 Variance analysis of cAMP contents in chlamydospores

2.4 不同颜色厚垣孢子中cAMP含量比较

将稻曲病菌厚垣孢子按照1.2.1所述的条件进行样品处理，并以1.2.3的色谱条件进行检测。通过样品所得峰面积，根据标准曲线的回归方程，参照1.2.4计算出样品中cAMP的含量。不同颜色稻曲病菌厚垣孢子中cAMP含量见表4。

表4 不同颜色厚垣孢子cAMP相对含量Table 4 cAMP contents in the different color chlamydospores

由表4可知，黄色厚垣孢子中cAMP平均含量达到12.805 0 μg/mL，黑色厚垣孢子中 cAMP平均含量为4.171 7 μg/mL。黄色厚垣孢子中的cAMP含量较黑色厚垣孢子中的含量高。

3 讨论

本研究采用超声-水浴结合法黄绿色稻曲病菌厚垣孢子中cAMP提取的不同条件进行了优化比较，得到cAMP得率最高的提取条件:超声破碎时间10 min(功率400 W、间歇时间2 s)，水浴温度80℃，物料比为1∶100。

目前国内外对于cAMP提取检测的方式不多，主要集中于酶联免疫、放射免疫以及HPLC法，且多用于动植物细胞，如苏豫梅等［12］用HPLC法对大枣中cAMP进行了提取检测，李建华等［13］用放射免疫法对人体血清中cAMP进行了提取检测，Kimio Uematsu等［14］采用酶联免疫法提取并检测了小列当种子中的 cAMP。对于真菌中cAMP 含量检测，段志兵等［15］与 Chang WQ 等［16］采用了酶联免疫法对绿僵菌和白色念珠菌中的cAMP含量进行了检测。此方法通过加入细胞裂解剂，使细胞破碎，经过特异抗体标记cAMP，再通过特异抗体的显色反应，间接检测cAMP的含量。由于稻曲病菌厚垣孢子壁厚，结构紧密的特质［17］，细胞裂解剂并不适用，所以实验参考燕玮婷等［8］对稻曲病菌厚垣孢子的破壁方式，采用超声-水浴结合来进行稻曲病菌厚垣孢子的破壁，再通过HPLC直接检测cAMP的含量，此方法直接、简单且得率高。

已有研究表明，cAMP参与了黑粉病菌、酿酒酵母以及稻瘟病菌的形态发育调控［18］。Borges-Walmsley MI［19］和 D'Souza CA 等［20］发现，cAMP在植物致病性真菌生长发育和致病性的过程中，扮演着极其重要的角色。Takano Y等［21］和Janisiewicz WJ等［22］对 Colletotrichum lagenarium 和Monilinia fructicola的研究表明cAMP含量水平会影响其分生孢子萌发及附着胞的生长，并且影响真菌的致病性。Li Qin等［23］发现在PDA条件下，cAMP可以诱导Coniothyrium minitans产孢缺陷性菌株重新产孢。Tzima A等［24-25］通过基因水平研究表明cAMP-PKA途径调控Verticillium dahliae产孢、菌核形成以及致病性。本研究通过超声-水浴结合法测得的稻曲病菌黄色厚垣孢子中cAMP平均含量达到12.805 0 μg/mL，黑色厚垣孢子中cAMP平均含量为4.171 7 μg/mL。很明显稻曲病菌厚垣孢子由黄色转换为黑色，其厚垣孢子的cAMP含量显著降低。现有研究获悉，稻曲病菌黄色厚垣孢子萌发率显著高于黑色，基于本研究推测cAMP可能参与稻曲病菌厚垣孢子萌发和休眠的调控，其cAMP在稻曲病菌厚垣孢子中萌发和休眠的确切功能性有待于进一步研究。

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