甲型流感病毒M1基因真核表达载体的构建及其表达

刘 静，许永庆，王 冰，曾 胜，戚菲菲，刘北星*

(1.中国医科大学基础医学院免疫学教研室，辽宁沈阳 110001;2.中国医科大学附属盛京医院肝胆脾外科，辽宁沈阳 110004;3.沈阳市疾病预防控制中心，辽宁沈阳 110031)

疫苗接种是预防流感病毒感染、减轻临床病情及降低死亡率的关键措施。目前普遍采用的流感病毒疫苗是病毒表面抗原亚单位疫苗［1］。用该亚单位疫苗预防流感尚存在所接种的疫苗未必与当年流行的病毒亚型一致、诱导的细胞免疫应答效果不理想等诸多缺憾［2-3］。DNA疫苗又称核酸疫苗、基因疫苗，是指通过不同的方式导入机体后，将含有编码抗原序列的DNA质粒转染至宿主细胞，使抗原在宿主细胞内表达，继而被抗原提呈细胞获取，提呈抗原信息诱导免疫应答，使被接种动物获得相应的免疫保护，以达到预防、治疗疾病的目的［4］。它不仅能诱导机体产生体液免疫，也可有效地诱导抗原特异性细胞免疫应答;DNA疫苗还具备例如诱导免疫记忆以及不存在减毒活疫苗所潜在的恢复毒性的危险等优势［5］。目前，有关流感病毒DNA疫苗的开发研制及其免疫途径的研究工作受到国内外学者的重视。用携带流感病毒血凝素(HA)或神经氨酸酶(NA)蛋白编码基因的DNA疫苗或多基因联合的HA/NADNA疫苗经肌肉注入动物体内，可使80%以上的实验动物获得对该型流感病毒的免疫力［6-7］。但由于流感病毒表面膜抗原极易变异，故极难准确预测当年的流感病毒流行株。建立对流感病毒具有普遍保护作用的流感病毒通用疫苗，如应用编码流感病毒保守蛋白(核蛋白 NP，基质蛋白 M)的DNA疫苗免疫动物，诱导其产生适应性应答及交叉保护免疫，从而保护免疫个体于同亚型及异亚型病毒的致死性攻击［5，8-10］，成为目前流感病毒疫苗研究工作者的关注热点。本研究旨在构建流感病毒M1蛋白的真核表达载体，并探究脂质体作为DNA疫苗运载体对DNA疫苗表达水平的影响，为开发研制经口流感病毒保守蛋白DNA疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 Vero细胞又名非洲绿猴肾细胞，为本实验室保存细胞株。用含10%FCS的DMEM常规传代培养。

1.1.2 病毒 流感病毒 Influenza A/FM/1/47(H1N1)由沈阳市疾病预防控制中心提供，用非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞传代培养。病毒滴度以TICD50(50% tissue culture infectious dose)表示。

1.1.3 试剂 真核表达载体pcDNA3.1(+)、感受态大肠埃希菌DH5α、限制性内切酶XhoⅠ、NotⅠ、T4连接酶及Trizol试剂等购于TaKaRa公司。琼脂糖凝胶DNA快速纯化回收试剂盒、高纯度质粒小量快速抽提试剂盒购于北京原平皓生物技术有限公司。脂质体Lipofectamine购于Invitrogen公司。鼠抗人流感病毒H1N1-M1单克隆抗体购于SANTA公司。FITC标记的羊抗鼠IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成及RT-PCR 依据H1N1流感病毒DNA序列，设计流感病毒M1蛋白引物，引物序列为:上游引物5'-CACAGCGGCCGCCAAATGAGTCTTCTAACCGA-3'设有 NotⅠ酶切位点，下游引物5'-CACACTCTCGAGTTACTCCAGCTATGCTGA-3'设有 XhoⅠ酶切位点。按照 one-step RT-PCR试剂盒的说明，使用上述引物反转录后进行PCR扩增。扩增条件为:60℃ 1 min;42℃10 min;50℃30 min;95℃预变性15 min;94℃变性30 s;54℃退火30 s;72℃延伸2 min;共35个循环。1%琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物。

1.2.2 pcDNA3.1(+)-M1 真核表达载体的构建及PCR鉴定 PCR产物与pcDNA3.1(+)质粒经限制性内切酶XhoⅠ和NotⅠ双酶切后，获得约1 000 bp的目的基因片段和5.4 kb载体片段。将目的基因片段和载体片段按1∶4摩尔比例加入到连接反应体系中，在T4连接酶的作用下16℃过夜连接，连接产物转化至感受态大肠埃希菌DH5α中。用Amp抗性筛选细菌菌落，提取质粒DNA。NotⅠ和XhoⅠ双酶切、PCR鉴定筛选阳性克隆。

1.2.3 重组质粒体外转染及表达 转染前一天，将常规传代培养的Vero细胞接种于放置了无菌载玻片的6孔培养板中，细胞浓度为2×106个细胞/孔。待细胞长成单层后加入100 μL/孔DNA质粒/Lipofectamine 2000混合物，37℃ 5%CO2孵箱培养32 h。取出载玻片，4%多聚甲醛固定15 min，5%BSA封闭30 min后加入抗流感病毒H1N1-M1蛋白的单克隆抗体，4℃过夜，PBS冲洗3次，加入FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃温箱孵育1 h。50%甘油封片，荧光显微镜鉴定DNA质粒转染和表达。同设空质粒和细胞对照。

2 结果与分析

2.1 利用RT-PCR技术扩增Influenza A/FM/1/47(H1N1)基因

从感染细胞中提取总RNA，在流感病毒M1蛋白基因引物下，RT-PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳，在1 000 bp位置上发现特异性条带，其与流感病毒H1N1的M1基因片段大小一致，结果表明目的基因扩增成功。电泳结果见图1。

2.2 构建含目的基因的pcDNA3.1(+)-M1重组质粒及PCR初鉴定

用限制性核酸内切酶处理M1基因和质粒载体pcDNA3.1(+)，T4连接酶连接目的基因片段与质粒载体，并将其转化至大肠埃希菌。挑取Amp抗性细菌菌落，扩增并提取重组质粒DNA。以重组质粒为模板，在M1基因引物作用下进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳发现在1 000 bp位置上出现目的条带，该条带大小与M1基因片段一致，由此说明插入目的基因片段存在，重组质粒构建成功。结果见图2。

图1 RT-PCR基因产物的琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Amplification of M1 gene by RT-PCR

图2 重组pcDNA3.1-M1质粒的凝胶电泳图Fig.2 Identification of recombinant Influenza A virus pcDNA3.1-M1 by PCR

2.3 流感病毒Influenza A/FM/1/47(H1N1)M1重组质粒(pcDNA3.1-M1)的鉴定

将用XhoⅠ和NotⅠ酶切重组质粒，后经1%琼脂糖凝胶电泳。结果见图3。酶切的重组质粒在约1 000 bp处出现条带，表明重组质粒中插入了约1 000 bp的目的基因。进一步证实重组质粒构建成功。

图3 双酶切鉴定重组质粒pcDNA3.1-M1Fig.3 Identification of recombinant plasmids digested by restriction endonucleases

2.4 免疫荧光技术鉴定重组 pcDNA3.1(+)-M1质粒体外转染水平

将脂质体包裹的pcDNA3.1(+)-M1及空质粒pcDNA3.1(+)转染至Vero细胞，免疫荧光染色后观察细胞转染情况。结果发现脂质体包裹的pcDNA3.1(+)-M1质粒可成功转入目的细胞，并在细胞中表达M1基因编码的蛋白。转染32 h后，正置荧光显微镜下可观察到发出绿色荧光的细胞(图4a)。与脂质体包裹的重组DNA疫苗相比，裸质粒转染组转染水平较低(图4b)。空质粒转染组未发现荧光阳性细胞(图4c)。

图4 pcDNA3.1(+)-M1重组质粒在Vero细胞中转染及表达(20×)Fig.4 Expression of DNA vaccine plasmids in Vero cells(20 × )

3 讨论

自20世纪90年代初首次报导应用DNA疫苗预防免疫以来，DNA疫苗越来越显示出其实际的免疫效果和广阔的应用价值。DNA疫苗因能同时刺激机体体液免疫和细胞免疫而受到国内外疫苗研究工作者的青睐。目前研究流感病毒DNA疫苗最多的是棘突蛋白HA/NA疫苗。尽管棘突蛋白免疫原性强，是制备流感病毒DNA疫苗的重要目的抗原，但由于棘突蛋白基因突变频繁，故很难用HA/NA DNA疫苗达到针对各种流感病毒的免疫效果。流感病毒M蛋白相对保守，具有型特异性。针对A型流感病毒M蛋白建立的免疫保护，一定程度上可以抵御A型流感病毒的不同亚型病毒的攻击。有文献报道流感病毒M蛋白DNA疫苗可诱导CD8+CT L和CD4+T h细胞的免疫应答，抵御流感病毒不同亚型的攻击［11］，从而进一步证实M基因是构建流感病毒通用疫苗的一个较为理想的靶基因。

在本研究中，利用RT-PCR技术扩增H1N1流感病毒的M1基因片段，并将其转染至真核载体pcDNA3.1(+)中，成功获得真核细胞表达质粒pcDNA3.1-M1DNA疫苗。为提高重组质粒在真核细胞中的表达水平，利用脂质体作为重组质粒的运载体。研究表明脂质体作为DNA疫苗的运载体，不仅能保护DNA疫苗抵御环境因子的破坏(尤其是DNA疫苗经口免疫时)，更能有效提高重组质粒的转染和表达水平，诱导机体体液和CTL应答［12-13］。本实验将 PolyFect脂质体与pcDNA3.1-M1质粒按一定比例混匀后转染到Vero细胞，结果表明PolyFect脂质体可将重组质粒成功转入目的细胞，并提高其转染率及其在细胞中的表达水平。本实验通过构建表达甲型流感病毒保守蛋白M1的真核表达质粒pcDNA3.1-M1，明确了脂质体作为DNA疫苗搬运体在M1DNA疫苗转染及表达方面所发挥的作用，为下一步的动物实验并探究DNA疫苗经口免疫途径奠定实验基础。

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