蛋氨酸脑啡肽单独或联合IL-2、IFN-γ对小鼠CD4+T细胞作用的研究

夏燕杰，孙立群，李荣辉，单风平

(1.牡丹江医学院红旗医院检验科，黑龙江牡丹江 157000;2.中国医科大学基础医学院免疫教研室，辽宁沈阳 110001)

蛋氨酸脑啡肽(Methionine Enkephalin，MENK)，是由肾上腺产生的前激素和前脑啡肽衍生而来，是一种由5个氨基酸残基组成的内源性阿片肽［1］。近年来研究表明，MENK不但具有神经内分泌免疫系统调节活性等多种生理功能，也是一类重要的细胞因子，阿片肽与细胞表面不同的受体结合后可以产生不同的生物学效应。蛋氨酸脑啡肽受体又称阿片生长因子受体(Opioid growth factor receptor，OGFr)，经典 OGFr受体可分为 μ(mu)、δ(delta)、κ(kappa)等几种亚型［2］。机体免疫细胞表面广泛存在着这些受体，如T淋巴细胞，巨噬细胞等。MENK通过与这些受体的相互作用而起到免疫调节作用，包括增加免疫系统T淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞活性，增加细胞因子 IL－2、γ－干扰素释放等［3］，MENK 还抑制肿瘤细胞生长。在过去的研究中，证明了MENK单独或与其他细胞因子(IFN－γ或IL－2)联合应用能增强机体免疫细胞的功能，但是作用机制尚不清楚，特别是对CD4+T细胞的作用机理，经MENK刺激后CD4+T细胞数量和活性的变化，细胞因子产生情况，至今未见报道。CD4+T细胞是体内特异性细胞免疫的重要细胞亚群，本实验通过体内外MENK 单独或联合 IL－2、IFN－γ 对 C57BL/6小鼠CD4+T细胞数量，CD4+T细胞mRNA表达量以及细胞因子产生量的变化，来阐明MENK对CD4+T细胞的免疫效应，为MENK的潜在临床应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6～8周龄健康♀C57BL/6小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，SPF级。

1.1.2 试剂 蛋氨酸脑啡肽样品(Penta Biotech Inc.公司，美国);Recombinant Murine IL－2，Recombinant Murine IFN－γ(PEPROTECH，英国);RTPCR试剂盒，琼脂糖(TaKaRa公司，日本);Trizol试剂(Invitrogen公司，美国);CD4+T细胞分选试剂盒，FITC－CD4 流式抗体(B.D.公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 体内实验动物分组及腹腔注射 C57BL/6小鼠，18～20 g，雌性，随机分为7组，每组5只，分别为对照组(生理盐水)、MENK(20 mg/kg)、IL－2(104U/kg)、IFN－γ(105U/kg)、MENK+IL－2组(20 mg/kg+104U/kg)、MENK+IFN－γ 组(20 mg/kg+105U/kg)和 MENK+NX［3］(20 mg/kg+10 mg/kg)。腹腔注射，每24 h给药1次，连续给药7 d。给药剂量依据:在预实验中发现，当按上述剂量给药时，小鼠开始出现明显的免疫反应(以脾脏T淋巴细胞的增殖反应作为考察指标)。颈椎脱位处死小鼠进行半定量RT－PCR、流式细胞术、ELISA等相关检测。

1.2.2 体外CD4+T细胞培养与处理 每批标本需要2～3只小鼠，颈椎脱位处死75%的乙醇中浸泡1～2 min，无菌取出小鼠脾脏，用10%FBSRPMI 1640培养液制成细胞悬液，1 000 g离心10 min，用红细胞裂解液裂解红细胞，RPMI 1640洗涤2次，以含10%FBS－RPMI 1640调整细胞终浓度为107个/mL。一部分随机进行如下分组:空白对照组(不加处理因素)，实验组MENK(10－12mol/L)、IL－2(200 U/mL)、IFN－γ(500 U/mL)、MENK+IL－2(10－12mol/L+200 U/mL)、MENK+IFN－γ(10－12mol/L+500 U/mL)和 MENK+NX［4］(10－12mol/L+50 ng/L)。每组设3个复孔于24孔板，37℃、5%CO2孵箱培养48 h后，流式细胞术检测CD4+T数量;一部分磁珠负选试剂盒分离纯化CD4+T细胞，流式细胞术检测CD4+T细胞纯度＞89%。计数纯化后的 CD4+T细胞，用10%FBS－RPMI 1640悬浮细胞沉淀于24孔板，调整细胞数为3×106个/mL，经 PHA(终浓度20 μg/mL)进行常规刺激48 h后随机进行如下分组:空白对照组(不加处理因素)，实验组MENK(10－12mol/L)、IL－2(200 U/mL)、IFN－γ(500 U/mL)、MENK+IL－2(10－12mol/L+200 U/mL)、MENK+IFN－γ (10－12mol/L+500 U/mL)和MENK+NX［4］(10－12mol/L+50 ng/L)。每组设3个复孔，于37℃、5%CO2孵箱继续培养。刺激48 h后收集上清冻存于－70℃，用于ELISA检测IL－2、IFN－γ 含量;细胞沉淀计数后冻存于 Trizol中，用于提取RNA，RT－PCR半定量检测。

1.2.3 流式细胞术检测CD4+T细胞数量 体内处理组小鼠颈椎脱位处死，浸入75%的乙醇中浸泡1 ～2 min，无菌取出小鼠脾脏，用 10%FBS－RPMI 1640培养液制成细胞悬液，1 000 g离心10 min，用红细胞裂解液裂解红细胞，RPMI 1640洗涤2次。以含10%FBS－RPMI 1640调整细胞终浓度为107个/mL。取0.1ml细胞悬液至流式管中，106个细胞加1 μL FITC标记的CD4抗体，涡旋振荡10 s，4 ℃避光30 min。2%FBS－PBS 洗液洗涤2次，1 000 r/min，离心10 min，弃上清，向细胞沉淀中加 2%FBS－PBS 0.5 mL，上机检测。

1.2.4 半定量 RT－PCR CD4+T细胞沉淀中加入Trizol试剂，按说明书提取RNA，所提RNA于紫外分光光度计下检测其纯度(OD260nm/OD280nm=1.8～2.0)并进行定量。根据GenBank中公布的基因序列，用Primer5.0软件设计PCR特异性引物。引物序列如下:

引物名称 引物序列 片段长度/bp CD4+T细胞5＇－GGCAACTTGGTGTGAATGAC－3＇ 110 mRNA上游引物CD4+T 细胞 5＇－CCTGTGTTCCATGTAGTGGC－3＇mRNA下游引物β－actin 上游引物 5＇－TCAGAAGGACTCCTATGTGG－3 500 β－actin 下游引物5＇－TCTCTTTGATGTCACGCACG－3＇

按TaKaRa反转录试剂盒将RNA转为cDNA后－20℃贮存备用。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，以β－actin作为内参，以靶基因/βactin灰度比值作为mRNA的相对表达丰度进行半定量检测。

1.2.5 ELISA 法检测 CD4+T 细胞上清中 IL－2、IFN－γ水平 用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验检测细胞培养液上清中IL－2、IFN－γ的含量，试验按照购买的ELISA试剂盒的步骤来操作。反应终止后用酶标仪检测450 nm吸光度值，再根据标准曲线确定所测细胞因子的浓度。应用SoftMax Pro4.3.1 LS软件分析，绘制标准曲线，计算细胞因子含量(pg/mL)。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS17.0软件包进行统计学分析，实验结果以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异显著。用Excel软件对所获得数据进行分析、处理图表。

2 结果与分析

2.1 流式细胞术检测CD4+T细胞数量结果

体内外MENK组小鼠脾CD4+T细胞的数量与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05);体内组 MENK 联合 IL－2、IFN－γ 与 MENK 单独作用时比CD4+T细胞的数量差异具有统计学意义(P ＜0.05);体外组 MENK 联合 IL－2、IFN－γ 与MENK单独作用时比CD4+T细胞的数量差异无统计学意义(P＞0.05);体内外纳洛酮封闭组CD4+T细胞数量与MENK相比差异具有统计学意义(P ＜0.05)，见图1。

图1 体内外实验组小鼠脾CD4+T细胞数量Fig.1 The percent of CD4+T cells in splenocyte of mice

2.2 体内外实验组小鼠脾CD4+T细胞mRNA水平表达

体内外实验组小鼠脾CD4+T细胞mRNA的表达，各组与对照组相比，差异具有统计学意义(P ＜0.05);体内 MENK+IL－2 组、MENK+IFN－γ组与MENK组相比，CD4+T细胞mRNA的表达量差异具有统计学意义(P＜0.05);体外MENK+IL－2 组、MENK+IFN－γ 组与 MENK 组相比，CD4+T细胞mRNA的表达量差异无统计学意义(P＞0.05);纳洛酮封闭组CD4+T细胞mRNA表达量与MENK相比差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

图2 体内外实验组小鼠脾细胞CD4+T细胞RT-PCR扩增结果Fig.2 RT－PCR confirmation of mRNA expression of CD4+T cell in murine splenocytes

2.3 ELISA检测CD4+T细胞上清液中IFN-γ的分泌水平

体内外不同药物处理组作用48 h后CD4+T细胞上清液中IFN－γ的分泌水平见图3，MENK组与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。体内实验中，MENK+IL－2组与MENK组相比差异具有统计学意义(P＜0.05);体外实验中，MENK+IL－2组与MENK组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。纳洛酮组与MENK组比IFN－γ水平差异具有统计学意义(P＜0.05)，显示MENK作用可以被纳洛酮阻断。

2.4 ELISA检测CD4+T细胞上清液中IL-2的分泌水平

体内外不同药物处理组作用48 h后CD4+T细胞上清液中IL－2的分泌水平结果见图4。各实验组与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05);体内实验中，MENK+IFN－γ 组与 MENK组相比差异具有统计学意义(P＜0.05);体外实验中，MENK+IFN－γ组与MENK组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。纳洛酮封闭组与MENK组比IL－2水平差异具有统计学意义(P＜0.05)，显示MENK作用可以被纳洛酮阻断。

图3 体内外不同实验组小鼠IFN-γ分泌水平检测结果Fig.3 IFN－γproduction post treatment in vitro and in vitro

图4 体内外不同实验组小鼠IL-2分泌水平检测结果Fig.4 IL－2 production post treatment in vitro and in vitro

3 讨论

MENK是一种内源性阿片肽，大量的实验已经表明MENK对机体多种细胞功能有调节作用，近年来MENK已经被认为是一种新型细胞因子，现已人工合成。机体免疫细胞表面广泛存在着阿片受体，MENK通过与这些受体的相互作用而起到免疫调节作用。MENK主要与表达上述受体的免疫细胞结合后，可双向调控胞内cAMP、钙离子、蛋白激酶K以及蛋白激酶A的水平，通过影响第二信号通路而发挥免疫调节效应。特别是当机体受到感染时，这种免疫调节作用更加明显。与MENK结合的该种受体也被发现表达在肿瘤细胞上，表现对肿瘤的生长有抑制作用［4－7］。

IL－2是免疫调节中起重要作用的T细胞因子，有多种生物学功能。它能激活多种免疫细胞，特别是诱导T淋巴细胞增殖，发挥免疫效应;同时能促进MØ和NK细胞等的增殖，还具有诱生分泌多种细胞因子等免疫活性物质。通过复杂的免疫调节使机体表现出抗肿瘤、抗感染、改善免疫功能和状态等。另外，有研究发现，MENK能促进人 T 细胞 IL－2 分泌和 IL－2 受体表达［8］。

IFN－γ是一种具有免疫调节作用的干扰素，主要由活化的Th细胞和NK细胞产生。其生物学功能主要是免疫调节，诱导多种抗原提呈细胞表达MHC－Ⅰ/Ⅱ类分子，活化单核－巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞，促进Th1细胞发育和抑制Th2细胞活化与增殖，刺激B细胞产生的抗体类型向调理素方向转变。此外，IFN－γ可以激活机体的免疫细胞，如T淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞等杀死肿瘤细胞。

Elka Gabrilovac等［9］研究表明，MENK 可诱导小鼠T细胞的增殖能力。Foris等证实低剂量(10－9～10－12mol/L)MENK 可以增强 ADCC 作用，而高剂量 MENK(10－5～10－6mol/L)可以抑制ADCC作用［10］。本实验用低剂量MENK单独或联合 IL－2、IFN－γ 对 C57BL/6 小鼠进行体内外刺激，实验中CD4+T细胞的数量与CD4分子mRNA表达量及细胞因子的分泌量一致，体内MENK单独或联合 IL－2、IFN－γ 不仅能增加小鼠脾CD4+T细胞的数量及CD4分子mRNA表达量，并且能促进细胞因子 IL－2、IFN－γ 的分泌。MENK对CD4+T细胞免疫效应的上调作用不仅是直接增加其数量，同时也可能通过增加其表面阿片受体的含量来间接调节。体内外加入纳洛酮封闭组，CD4+T细胞数量及细胞因子含量与MENK组相比明显减少，说明MENK的这种作用可被纳洛酮完全阻断。另外，本研究中在体内组MENK联合IL－2或IFN－γ对CD4+T细胞作用比单独作用时显著增强，而体外组当MENK联合IL－2或IFN－γ对CD4+T细胞作用时无明显增强，体内外并未得到完全相同的结果，说明在体内MENK联合IL－2或IFN－γ对CD4+T细胞有协同作用，同时表明体内环境因素可能对MENK作用于CD4+T细胞起到影响作用。体内环境下免疫系统甚至包括内分泌系统形成的调节网络，MENK除了作用于CD4+T细胞之外，还同时作用于其他免疫细胞如NK、CD8+T、中性粒细胞、巨噬细胞等，这些细胞激活后都能释放大量细胞因子，如 IL－12、IL－2、IL－6、IFN－γ。IFN－γ 可激活巨噬细胞从而具有更强的提呈抗原和激活CD4+T细胞的能力有关，从而对CD4+T细胞形成综合调节。本研究不仅为进一步研究MENK在免疫调节方面的影响提供重要的理论依据，而且为今后研究MENK在免疫细胞的作用机制提供适宜的研究模型，为临床应用MENK治疗肿瘤和感染性疾病提供了部分实验依据。

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