大孔树脂纯化五味子总木脂素、总三萜工艺研究

莫永俊 汪春泉 王 琦 赵晓宏

1.吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，吉林长春 130118；2.北京协和医学院 中国医学科学院药用植物研究所，北京100193

五味子 Schisandra chinensis（Turcz.）Baill 为著名中药，具有益气生津、敛肺滋肾、止泻、安神等功效，其主要活性成分为总木脂素和总三萜。现代药理学研究表明，五味子总木脂素具有保护心肌、降血压、降血脂等功效[2]，三萜类物质具有抗病毒、抗肿瘤等功效[3-4]。大孔树脂具有交换速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长等诸多优点，对各类中药有效组分以及中药复方有效部位的精制纯化发挥了重要的作用[5-6]。本文旨在应用大孔吸附树脂同时纯化五味子中总木脂素总三萜，以树脂对总木脂素的吸附解析性能为主要考察指标，兼顾总三萜的吸附解析率，筛选适宜的大孔树脂类型，确定最佳的纯化工艺。本文首次采用梯度洗脱法同时纯化五味子总木脂素总三萜，终产品中有效物质含量显著提高，为高纯度五味子总木脂素总三萜的工业生产提供数据支持。

1 仪器与试药

W-2102 PC型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；Waters 高效液相色谱系统（Waters2489 紫外检测器，Waters2707 自动进样器，Waters Empower 3 工作站）。

五味子药材（产地为吉林省白山市，由中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所赵晓宏副研究员鉴定）；五味子醇甲（中国药品生物制品鉴定所，批号：110857-201010）；齐墩果酸（中国药品生物制品鉴定所，批号：110709-200505）；D-101、D-201、AB-8、ADS-7、S-8 型大孔吸附树脂（购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；甲醇乙醇分析纯（北京化工厂）；甲醇色谱纯（Burdick＆Jackson公司）。

2 方法与结果

2.1 含量测定[1]

2.1.1 五味子总木脂素含量测定

精密称取五味子醇甲0.515 mg，置于10 mL 容量瓶中，甲醇定容，摇匀即得。精密量取对照品溶液100、150、200、250、300、350 μL，分别加甲醇定容至 10 mL，在 250 nm处测定吸光度，以五味子醇甲浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为Y=115.14X+0.023 4，r=0.999 6，五味子醇甲在 0.021～0.072 mg 有良好的线性关系。

2.1.2 五味子总三萜含量测定

精密称取齐墩果酸4.760 mg，置于25 mL 容量瓶中，甲醇定容，摇匀即得。精密量取对照品溶液100、200、300、400、500、600 μL 挥干溶剂，加 0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液，0.8 mL 高氯酸，摇匀后60℃水浴15 min，冷却至室温，加入5 mL 冰醋酸摇匀，于546 nm 处测定吸光度，以齐墩果酸质量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为Y=7.972 7X-0.030 5，r=0.999 2，齐墩果酸在19.040～114.240 μg 范围内线性关系良好。

2.1.3 五味子醇甲含量测定

2.1.3.1 色谱条件 色谱柱为Cyncromis C18 柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇∶水=65∶35，检测波长为 250 nm，流速为1 mL/min，柱温为室温。理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于2 000。

2.1.3.2 含量测定 精密称取五味子醇甲对照品4.39 mg 置于25 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，过0.22 μm 微孔滤膜，摇匀即得。分别精密吸取对照品溶液4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μL，注入高效液相色谱仪，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到线性回归方程Y=5×106X-155678，r=0.999 5，五味子醇甲在 0.702～2.118 μg 线性关系良好。

2.2 五味子上样液的制备

五味子药材粉碎，加入10倍量的95%乙醇，加热回流3次，每次2 h，将醇提液冷却后过滤，回收乙醇，浓缩得到五味子乙醇提取浸膏，加适量的水稀释即得五味子上样液（五味子乙醇提取浸膏中总木脂素、总三萜、五味子醇甲的质量分数分别为5.80%、3.76%、0.75%）。

2.3 大孔吸附树脂型号筛选

2.3.1 静态吸附性能考察

分别精密称取不同类型已预处理的树脂各2 g，置于250 mL 具塞锥形瓶中，加入40 mL 五味子上样液（总木脂素浓度为 1.0 mg/mL），25℃恒温条件下振荡 24 h（100 r/min），充分吸附后，过滤，将滤液（吸附液）蒸干，测定其总木脂素、总三萜、五味子醇甲含量，计算比吸附量，结果见表1。

2.3.2 静态解析性能考察

取过滤后的树脂，加蒸馏水100 mL，25℃恒温振荡2 h（100 r/min），过滤后的树脂中加入100 mL 体积分数为95%的乙醇，25℃恒温振荡 24 h（100 r/min），过滤，将水洗滤液和醇洗滤液合并蒸干，测定滤液（解析液）中总木脂素、总三萜、五味子醇甲含量，计算解析率，结果见表1。

表1 5种类型大孔树脂的吸附和解吸性能

由表1 结果可知，与其他类型的树脂相比，AB-8型树脂对总木脂素、总三萜、五味子醇甲的吸附解析性能最好，故选择AB-8大孔树脂进行进一步的实验。

2.4 AB-8型大孔树脂吸附解析工艺条件优化

2.4.1 上样液浓度的影响

称取10 g AB-8型大孔树脂湿法装入色谱柱（树脂柱床体积约 10 mL），分别制备浓度为 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL（以总木脂素的含量计，均为175.00 mg）的五味子上样液，以1BV/h的流速通过树脂柱进行吸附，收集流出液，水浴蒸干后测定总木脂素、总三萜的含量，计算比吸附量，结果见图1。

图1 上样液浓度对总木脂素总三萜比吸附量的影响

由图1 结果可知当上样液浓度为1.5 mg/mL时，AB-8大孔吸附树脂对总木脂素的比吸附量最大，为11.79 mg/g；当上样液浓度分别为0.5、1.5 mg/mL时，对总三萜比吸附量最大，分别为7.97、7.44 mg/g。以树脂对总木脂素的吸附解析性能为主要考察指标，兼顾总三萜的吸附解析率，最终确定1.5 mg/mL 为最佳上样液浓度。

2.4.2 最大上样量的考察

将110 mL 五味子上样液（总木脂素浓度为1.5 mg/mL），以1BV/h的流速通过AB-8大孔树脂柱（10.0 g）进行吸附，分段收集流出液，每10 毫升一份，共接取11份，水浴蒸干测定其有效物质的含量。以流出液体积为横坐标，流出液中有效物质浓度为纵坐标，绘制泄露曲线见图2。

图2 泄漏曲线

由图2 泄漏曲线可知，上柱流出液达到7BV时，流出液中总木脂素浓度约为上样液浓度（1.5 mg/mL）的10%，说明总木脂素开始泄漏，上柱液为4BV时，总三萜开始泄漏；以总木脂素为主要考察指标，最终确定最大上样量为70 mL。

2.4.3 水洗量的考察[10]

由于蒸馏水对木脂素和三萜的洗脱能力很弱，用蒸馏水洗涤可除去糖类等水溶性杂质。配制70 mL 五味子上样液（总木脂素浓度为1.5 mg/mL），以1BV/h的流速通过AB-8大孔树脂柱（10.0 g），然后用蒸馏水以1BV/h的流速进行洗脱，分段收集过柱流出液，每10 毫升收集1份共15份。用Molish 反应检测糖的反应是否为阴性，9BV时Molish 反应为阴性，故确定蒸馏水的体积为9BV。

2.4.4 洗脱溶剂体积分数的考察[11]

配制70 mL 五味子上样液（总木脂素浓度为1.5 mg/mL），以1BV/h的流速通过AB-8大孔树脂柱（10.0 g），吸附完全后，用90 mL 蒸馏水以1BV/h的流速进行洗脱，然后分别用10BV的体积分数分别为10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇连续洗脱，洗脱流速为1BV/h，测定各个梯度洗脱液有效物质的含量，结果见图3、4。

图3 洗脱溶剂体积分数对有效物质含量的影响

图4 洗脱溶剂体积分数对有效物质质量分数的影响

由图3、4 结果可知用10%、20%、30%等低浓度乙醇洗脱所得组份中总木脂素和总三萜的质量分数较低，由90%，95%等高浓度乙醇洗脱所得组份中总木脂素和总三萜的质量分数也较低。综合考虑终产品中总木脂素和总三萜的含量和质量分数，首先采用30%乙醇洗脱除去杂质含量高组份，然后用80%乙醇洗脱得到有效物质含量高的组分。

2.4.5 洗脱溶剂用量的确定

将70 mL 五味子上样液（总木脂素浓度为1.5 mg/mL），以1BV/h的流速进行上柱，通过AB-8大孔树脂柱（10.0 g），90 mL 蒸馏水以1BV/h的流速洗脱树脂柱，30%乙醇洗脱树脂柱，流速为1BV/h，分段收集洗脱液，每10 毫升收集1份，共10份；然后用80%乙醇洗脱树脂柱，流速为1BV/h，分段收集洗脱液，每10 毫升收集1份，共12份，水浴蒸干流出液，测定其总木脂素和总三萜的含量，结果见图5、6。

由图5 结果表明当30%乙醇洗脱用量为9BV时，累积固形物的质量已达到总流出液固形物质量的99%；图6 结果表明当80%乙醇洗脱用量为10BV时，可将98%以上的有效物质含量高的组分洗脱下来，综合考虑有效物质的洗脱率、洗脱溶剂用量、洗脱时间等因素，最终选择30%乙醇洗脱用量为9BV，80%乙醇洗脱用量为100 mL。

2.5 验证试验

图5 低浓度乙醇洗脱曲线

图6 高浓度乙醇洗脱曲线

按照上述确定的纯化五味子总木脂素总三萜的工艺制备3 批样品，测定其中总木脂素、总三萜、五味子醇甲的含量。3 批样品中总木脂素含量分别为39.67%、39.59%、39.36%，平均值为39.55%；总三萜的含量分别为14.09%、13.84%、13.94%，平均值为13.96%；五味子醇甲含量分别为9.05%、8.89%、8.92%，平均值为8.95%；三者含量均显著提高，分别提高了6.8、3.7、11.9倍。经过一系列考察可知应用大孔树脂纯化五味子总木脂总三萜的工艺合理、可行，重现性较好。

3 讨论

应用大孔树脂同时纯化五味子总木脂素和总三萜的研究未见报道。本文通过对5 种不同类型的大孔树脂吸附解析性能考察，发现AB-8型大孔树脂最适合五味子总木脂素总三萜的精制纯化。通过动态吸附解析实验对各个工艺参数进行考察，最终确定AB-8型树脂最佳工艺条件。

本文首次采用梯度洗脱法同时纯化五味子总木脂素总三萜，首先用低浓度乙醇洗脱树脂柱以除去杂质含量高的组分，然后用高浓度乙醇洗脱树脂柱以获得有效物质含量高的组分。经过纯化后终产品中有效物质的含量显著提高，总木脂素质量分数由5.80%提高到39.55%，总三萜的质量分数由3.76%提高到13.96%，五味子醇甲质量分数由0.75%提高到8.95%，分别提高了6.8、3.7、11.9倍。

目前应用大孔树脂分离纯化五味子所得的终产品中有效物质的含量较低，因此患者服药量较大，并且过多的非有效成分可能会产生毒副作用。本文采用梯度洗脱法同时纯化五味子总木脂素和总三萜，为高纯度五味子有效组分的生产提供了理论依据，对传统中药五味子的开发利用具有重要意义。

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