台盼蓝染色鉴定拟南芥sdl1突变体的细胞死亡

支添添，周 舟，韩成云，任春梅，2*

(1湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128;2作物基因工程湖南省重点实验室，长沙410128)

细胞死亡在植物生长发育和抵抗逆境方面具有重要意义:在细胞水平上，细胞死亡是维持细胞数量平衡的重要手段;在发育中，细胞死亡有形态建成和去除无用组织细胞的作用，而且还是抵御病原物入侵和环境胁迫的重要机制之一［1］。植物在遇到环境胁迫如病害、高盐、水涝和低温时，某些部位需要发生细胞死亡来度过不良环境，这是植物在进化过程中自身形成的对环境的适应能力。台盼蓝(Trypan blue)或称台盼兰、锥虫蓝、曲利苯蓝，是一种高分子量的活性染色剂，分子量:960.8 OD［2］。它是细胞活性染料，常用于检测细胞死亡。细胞死亡检测被广泛应用于多个科研领域，如药物筛选［3］、细胞增殖测定［4］、药物毒性测定［5］、肿瘤药敏实验［6］等。目前最常用的检测细胞死亡的方法是台盼蓝染色法。

本实验以模式植物拟南芥为材料，采用台盼蓝染色的方法对细胞死亡进行检测，旨在确证突变体sdl1细胞死亡的发生，为进一步研究突变体sdl1奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂与仪器

拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Columbia(Col－0)及突变体sdl1，由本实验室提供;台盼蓝，L－乳酸:Amresco公司;苯酚:北京索莱宝科技有限公司;甘油:天津市恒兴化学试剂有限公司(A.R.);水合氯醛:国药集团化学试剂有限公司(A.R.);琼脂粉和蔗糖购自市场。

智能人工气候箱:PRX－450B;体视显微镜:Nikon C －DS。

1.2 培养方法

用消毒液(20%bleach+0.1%Triton100)将Col－0野生型及sdl1突变体种子浸泡8～10 min后，用无菌水清洗3～4次，铺种在含1%蔗糖的MS培养基上，4℃下春化3 d后转入设定光周期为16 h黑暗/8 h光照的人工气候箱生长5～8 d，培养温度22±2℃，光照强度80 ～120 μmol/m2·s，相对湿度65%。

1.3 染色方法

野生型拟南芥叶片和突变体拟南芥叶片浸泡在台盼蓝染液中，沸水浴染色2 min，自然冷却后室温染色过夜，后于1.25 g/mL(250 g水合氯醛用40 mL蒸馏水溶解，定容至200 mL)或1.12 g/mL(224 g水合氯醛用40 mL蒸馏水溶解，定容至200 mL)水合氯醛脱色3 d，每天换一次脱色液。体视显微镜观察细胞死亡情况并拍照记录。

台盼蓝染液配方:2.5 g台盼蓝溶于1 mL乳酚﹝25%乳酸(质量体积比)，23%水溶苯酚，25%甘油，其余是无菌水﹞。

2 结果与分析

2.1 sdl1突变体的表型

突变体sdl1从第6天开始，小苗叶片出现先萎蔫、后白化现象，第7天可看到突变体sdl1小苗叶片出现全绿、半萎蔫半绿、半绿半白、全白4种情况，并且停止生长，到第8天几乎所有突变体sdl1小苗的叶片全部白化。

2.2 不同天数突变体sdl1叶片白化率统计比较

分别将第6天、第7天、第8天叶片出现部分萎蔫、部分白化和完全白化的突变体sdl1株数进行统计。统计结果显示随着天数的增加，突变体sdl1小苗完全白化率随之增加，而全绿和部分白化的比率随之减少，说明随着天数的增加，突变体sdl1叶片白化的速度加快(表1)。

表1 不同天数突变体sdl1小苗叶片白化率比较

2.3 野生型Col－0及突变体sdl1的台盼蓝染色

对生长7 d的野生型Col－0和突变体sdl1小苗进行台盼蓝染色，并在体视显微镜下观察，发现只有突变体半萎蔫半绿小苗子叶萎蔫处出现蓝色沉淀，完全白化小苗和野生型小苗没有(图1)。

图1 生长7 d的拟南芥野生型小苗子叶(A)、突变体sdl1白化小苗子叶(B)以及萎蔫小苗子叶(C)的台盼蓝染色结果

3 结论

拟南芥野生型Col－0和突变体sdl1直接铺种于MS+1%sucrose培养基上，在光照周期为16 h黑暗/8 h光照条件下生长到第6天，突变体sdl1叶片开始出现部分萎蔫和白化，随着天数的增加植株叶片白化率不断升高，生长8～9 d后几乎所有突变体叶片全部变白，而野生型正常。经台盼蓝染色证实突变体sdl1发生细胞死亡，但完全死亡(完全白化)后不能被染色，所以台盼蓝染色只能对突变体sdl1细胞死亡的早期进行鉴定。野生型不能被染色是因为没有发生细胞死亡，白化部分猜测是由于细胞完全死亡，DNA降解，不能与台盼蓝结合形成蓝色沉淀，因而不能被染色。

［1］ Reape TJ，McCabe PF.Apoptotic － like programmed cell death in plants［J］.New Phytologist 2008，180:13 －26.

［2］ 齐世欣，李筱荣.台盼蓝染色在玻璃体视网膜手术中应用的研究进展［J］.国外医学眼科学，2005，29(4):263－266.

［3］ Li Q，Maddox C，Rasmussen L，et al.Assay development and high－through put antiviral drug screening against Bluetongue virus［J］.Antiviral Res，2009，83(3):267－273.

［4］ Ye YW，Wu JH，Wang CM，et al.Sox17 regulates proliferation and cell cycle during gastric cancer progression［J］.Cancer Lett，2011，307(2):124 －131.

［5］ Yan F，Zhang C，Zheng Y，et al.The effect of poloxamer 188 on nanoparticle morphology，size，cancer cell uptake，and cytotoxicity［J］.Nanomedicine，2010，6(1):170－178.

［6］ Wang CX，Huang LS，Hou LB，et al.Antitum or effects of polysorbate－80 coated gemcitabine polybutylcyanoacrylate nanoparticles in vitro and its pharmacodynamics in vivo on C6 glioma cells of a brain tumor model［J］.Brain Res，2009，1261:91－99.