液相色谱串联质谱用于原料药甲氧苄啶含量测定

石向群

(九江学院基础医学院 江西九江 332000)

甲氧苄啶，学名为2，4-二氨基-5-(3，4，5-三甲氧苄基)嘧啶，英文/拉丁名称为Trimethoprim(TMP)，为化学合成抗菌药， 临床上主要用于磺胺类药物的抗菌增效剂。陈瑞玲[1]在磺胺类药与甲氧苄啶的合理应用的研究中得出两者联合应用，可起到减缓细菌对药物产生耐药性和增强抗菌的作用。甲氧苄啶还能与多种抗生素及中药联合使用，能使抗菌谱扩大，抗菌活性大大增强。王新[2]等就甲氧苄啶对蒲公英体外抗菌增效作用进行研究，得出蒲公英与甲氧苄啶联用呈相加作用并确定甲氧苄啶对蒲公英体外抗菌增效的最佳剂量，为蒲公英与甲氧苄啶复方制剂的研制奠定基础。目前，2010版药典中收录的此类药物有甲氧苄啶、甲氧苄啶片和甲氧苄啶注射液[3]。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

液质联用仪：液相色谱串联质谱联用仪：Agilent 1200LC-6410B QQQ，电喷雾离子源(ESI)，液质软件Agilent MassHunter(包含采集软件Data Acquisition，定性软件Qualitative Analysis，定量软件Quangitative Data Analysis)；超纯水机：KL-UP-IV-20，成都康宁；电子分析天平：BT224S，赛多利斯。

甲氧苄啶对照品(中国药品生物制品检定所)、甲氧苄啶原料药(批号2010-10014，西安藻露堂药业公司)、甲醇(色谱纯)。

1.2 方法条件

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18 (2.1×30mm，3.5-Micron)；流动相：甲醇：水(50∶50)；检测波长：271nm；流速：0.2mL/min；手动进样；定量环：20μL；柱温：40℃。

1.2.2 质谱条件 正离子模式(ESI+)，离子源温度300℃，干燥气流速8L/min，雾化气压力35psi，毛细管电压4 000V，扫描模式为多重反应监测(MRM)，离子对m/z(291.1→230.1)，采样时间3min。

1.3 溶液配制

精密称取30mgTMP对照品于50mL的容量瓶中，加入50%的甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用作储备液(0.6mg/mL)。从储备液中精密吸取0.5mL溶液置50mL的容量瓶中，用50%的甲醇稀释定容，摇匀，作为母液(6μg/mL)。从母液中依次精密吸取100、180、260、340、420μL溶液于10mL容量瓶中，用50%的甲醇稀释定容，摇匀，分别为标1～5。

精密称取原料药30mg，置50mL的容量瓶中，加入50%的甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。从上述溶液中精密吸取0.5mL溶液置50mL的容量瓶中，用50%的甲醇稀释定容，摇匀，作为供试品母液。从供试品母液中精密吸取300μL溶液于10mL容量瓶中，用50%的甲醇稀释定容，摇匀，即得供试品溶液，平行制备3份。

2 结果

2.1 质谱条件优化

2.1.1 母离子扫描与破碎电压优化 在全扫描(Scan)的模式下，根据TMP化学结构性质，将扫描范围设为m/z 100～500，通过扫描标样找到了母离子m/z291.1。在选择性扫描(SIM)的模式下，分别用100、120、140、160V的破碎电压(Fragmentor)对标样进行扫描，结果发现，破碎电压为140时质谱峰最强。

2.1.2 子离子扫描与碰撞能量优化 在子离子扫描(Product Lon)的模式下，根据优化碰撞能量来寻找与母离子m/z 291.1对应的子离子。分别用15、20、25、30的碰撞能量(Fragmentor)对标样进行扫描。结果发现，在碰撞能量为20时，找到了与母离子m/z291.1有对应关系的子离子m/z230.1。

2.2 定量分析

采用正离子模式(ESI+)，多重反应监测(MRM)，母离子及子离子定量离子对为m/z(291.1→230.1)(如图1所示)，以离子峰面积作为定量依据。

图1 甲氧苄啶对照品溶液MRM多重反应监测质谱图

2.2.1 标准曲线测定 按1.3项下配得的对照品溶液，分别按1.2项下方法条件依次进样，在MRM模式下定量分析，以浓度为横坐标，离子峰面积为纵坐标进行线性回归(如图2)， 得回归方程为Y= 226.4143X+16606.3237， r=0.9967。结果表明， 甲氧苄啶在60～252ng/mL范围内，线性关系良好。

图2 甲氧苄啶对照品溶液标准曲线

2.2.2 精密度实验 按1.3项下配的标3溶液重复进样测量3次，测得结果分别是148.70、153.98、149.68ng/mL，RSD%为2.80%。

2.2.3 样品含量测定 按1.3项平行配制甲氧苄啶原料药的供试品溶液3份，按1.2项下方法条件依次进样。测定结果表明：RT保留时间分别为0.501、0.503、0.497，RSD为4.90%。供试品浓度分别为172.21、164.01、169.46 ng/mL，平均浓度为168.56 ng/mL ，RSD为2.48%。原料药甲氧苄啶含量分别为95.67%、91.11%、94.14%，平均含量为93.64% ，RSD%为2.48%。

2.2.4 加标回收实验 按1.3项平行配制甲氧苄啶原料药的供试品溶液3份，分别精密吸取4mL放入3个25mL的容量瓶中，再在各瓶中加入0.2mL(6μg/mL)的标样母液，用50%的甲醇定容至刻度，摇匀，依次进样。测定结果表明：加标溶液浓度分别为82.41、76.44、83.79 ng/mL，回收率分别为102.75、96.06、99.46%，平均回收率为99.42%，RSD%为3.36%。

3 讨论

《药典》(2010版)二部甲氧苄啶项下含量测定采用结晶紫作为指示剂，用高氯酸进行滴定的测量方法。本文利用液相色谱-串联质谱技术，样品经 HPLC分离后在离子源被离子化，然后进入质谱中，采用多重反应监测(MRM)，母离子m/z291.1与子离子为m/z230.1形成定量离子对。本方法专属性强，选择性高，其他组分的存在对测定没有干扰。

参考文献：

[1]陈瑞玲.磺胺类药与甲氧苄啶的合理应用[J].中国临床医生，2008，36(7)：18.

[2]王新，崔一喆，邵红，等.甲氧苄啶对蒲公英体外抗菌增效作用的研究[J].疾病防治，2010，37(2)：169.

[3]中华人民共和国药典委员会.中国药典(二部)[M].北京:化工出版社，2010.146.