芍药苷对THP-1 细胞CD147 表达及MMP-9 分泌的影响

王汉伟，李 静，王 景，高丰厚

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosis，SLE)为一病因未明的以多系统损害伴多种自身抗体形成为特征的自身免疫性疾病。患者体内可产生针对自身细胞核、胞质及胞膜抗原的抗体。临床常表现为发热、面部红斑、多形性皮疹、光过敏、多发性口腔溃疡、关节炎、多发性浆膜炎、血管炎、肾炎及中枢神经系统症状等。其中狼疮肾炎(LN)常常是终末期患者常见的死亡原因，但狼疮肾炎的病因至今尚未完全明确。主要认为是由多因素所致，如遗传、病毒感染免疫异常阳光或紫外线的照射、某些药物诱发及雌激素等引起的自身免疫炎性疾病。其引发的肾脏病变即LN 为典型的自身免疫复合物肾炎。研究表明，LN 存在多种细胞因子的异常表达，如CD147、IL-2、IL-6、IL-1、IL-4、MMP、TNF、TCAM-1、IFN 等在LN中表达均增高，说明细胞因子参与了LN 的发病。本文用THP-1 细胞作为模型，观察芍药苷(paeoniflorin，PAE)对THP-1 细胞的CD147 的表达及MMP-9 分泌的影响，以探讨芍药苷治疗狼疮肾炎的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 THP-1 细胞(中科院上海细胞库)，RPMI-1640 培养基、胎牛血清(Hyclone 公司)，芍药苷(上海扶生公司)，兔抗人CD147 抗体(BD 公司)，MMP-9 试剂盒(R﹠D 公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人THP-1 细胞接种于含10%胎牛血清、50 U/ml 青霉素、50 μg/ml 链霉素的RPMI 1640 培养液中，置于37℃、5% CO2饱和湿度的孵育箱中培养，每2～3 天换液1次。细胞长至80%时，1:2 传代培养，THP-1 细胞呈单个圆形悬浮生长，偶有细胞抱团及贴壁生长。将对数生长期细胞按1 ×106接种于六孔板中，用芍药苷(10－5mol/L)干预后，置37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养48 h，正常细胞设为对照组。

1.2.2 Western blot 检测CD147 蛋白的表达水平 收集同前处理的细胞，按1 ×106个细胞加入150 μl 的细胞裂解液，提取细胞总蛋白。制备12% SDS-PAGE 分离胶及5%的浓缩胶。根据样品蛋白浓度，按总蛋白量为20μg 计算每孔上样体积。电泳，转膜，再染色、洗膜，5%的脱脂奶粉封闭1～2 h，杂交袋内结合CD147-抗体(1:1 000)，HRP 标记鼠抗GAPDH(1:3 000)作为内参，4 ℃孵育过夜。次日RT 摇床上摇晃孵育1 h，TBS-T 洗膜10 min ×3 次，二抗加入HRP 标记的IgG1(1:2 500)，RT 下孵育2 h 后，TBS-T 洗膜2 次，再用TBS 洗膜1 次。用ECL 化学发光显色，曝光显影，冲洗X 线片，所得底片在成像系统中拍照，用Quantity one 软件分析得灰度值。分析CD147 总蛋白表达水平的变化，实验重复3 次。

1.2.3 ELISA 法检测MMP-9 按照试剂盒提供的方法，往每个孔中加入100μl 的Assay Diluent RD1-34。加100μl 的标准物，对照或是样品到每孔内，用封板膜封住。在RT 下孵育2 h。用400μl 的Wash Buffer 清洗。加200 μl 的MMP-9 Conjugate 到每个孔中，用新的橡胶膏条封住，在RT 下摇晃孵育1 h。向每孔加入200 μl 的显色试剂，RT 避光孵育30 min。向每孔加入50 μl 的终止液，颜色应该由蓝色变为黄色。酶标仪设定450 nm，在加终止液30 min 内读孔。

2 结果

2.1 Western blot 检测结果 以芍药苷(10－5mol/L)干预THP-1 细胞48 h 后收集细胞，Western blot 检测THP-1 细胞CD147 蛋白表达水平。结果显示以芍药苷(10-5mol/L)干预THP-1 细胞后，与正常对照组相比明显抑制了CD147 蛋白水平，CD147 蛋白平均分子量为58 kDa，GAPDH 内参为37 kDa。分析计算EMMPRIN/GAPDH 灰度比值(P＜0.05)具有统计学意义。

表1 芍药苷干预THP-1 细胞48 h 后CD147 蛋白灰度值变化(±s)

表1 芍药苷干预THP-1 细胞48 h 后CD147 蛋白灰度值变化(±s)

2.2 ELISA 法检测MMP-9 以芍药苷(10－5mol/L)干预THP-1 细胞48 h 后收集细胞上清，ELISA 法检测THP-1 细胞分泌MMP-9 表达量。结果显示以芍药苷(10－5mol/L)干预THP-1 细胞后，与正常对照组相比，上清中MMP-9 浓度明显下降，与未干预对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 芍药苷干预THP-1 细胞48 h 后MMP-9 分泌量变化(±s)

表2 芍药苷干预THP-1 细胞48 h 后MMP-9 分泌量变化(±s)

3 讨论

SLE 是一种多器官受累的自身免疫性疾病，血管炎是SLE 的基本病理改变，最常累及皮肤和肾脏，但也可累及包括中枢和外周神经系统在内的许多脏器，并且血管炎与SLE 患者的死亡率密切相关，因此对血管炎的抑制在SLE 的治疗中占有重要意义［1］。活动性LN 如不及时控制，可迅速引起衰竭而死亡［2］。

CD147 为一分子量为58KD 的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，MMPs 是一组含锌的钙离子依赖蛋白，属肽链内切酶家族，主要参与细胞外基质的代谢，MMP-9 属明胶酶，主要功能是降解细胞外基质，在胚胎发育、创伤修复、炎症、肿瘤、结缔组织疾病发生发展中起重要作用［3］。MMP-9通过降解血管基底膜的主要成分，使内皮细胞通透性增加，有利益炎症细胞侵入血管壁引起炎症反应，并与TNF-a 和IL-1B等细胞因子相互作用放大炎症反应，参与SLE 发病的多个环节［4］。有研究表明［5］SLE 活动期PBMC 中CD147 mRNA 的表达水平显著高于正常人。用ELISA 方法检测健康人和SLE 患者的血清MMP-9 浓度，显示SLE 患者血清MMP-9 浓度降低，活动期较稳定期浓度也降低，同时用糖皮质激素治疗后MMP-9 浓度也降低，因此认为MMP-9 可以作为反映SLE 疾病活动程度、肾脏损害及疾病改善的指标之一［6］。MMP-9 的过度产生可诱导微血管的损伤加剧内皮细胞损伤促进炎症细胞穿过基底膜从而更衣导致血管炎的发生［7］。既往研究表明SLE患者血清PBMCsCD147 的表达明显高于健康对照组，且与患者病情活动呈正相关，同时MMP-9 分泌也增高，通过相关性分析表明SLE 患者PBMCs 表面CD147 的表达与PBMCs 分泌MMP-9 的能力正相关，与PBMCsMMP-9 m-RNA 的表达正相关，因此推测SLE 患者PBMCs 高表达的CD147 诱导MMP-9分泌增多［8］。PAE 是芍药的主要活性单体成分，毒性极低，具有抗炎、免疫调节和神经保护等多种作用。目前其合成化合物白芍总苷已经是批准的治疗风湿免疫性疾病的临床用药，PAE 是其主要化学成分，本实验通过给予PAE 干预THP-1 细胞后发现其表达CD147 水平是下降的同时MMP-9 分泌也是减少的，这与文献报道也是相一致的，这也为PAE 治疗LN 提供了理论依据及可能的机制。

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