长期围封对不同放牧强度下草地植物和AM真菌群落恢复的影响

周文萍，向 丹，胡亚军，李志芳，陈保冬，*

(1.中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193;2.中国科学院生态环境研究中心，北京 100085)

草地生态系统是陆地上最重要、分布最广的生态类型之一。在我国，草地面积占国土面积的41.7%，约4亿hm2［1］。20世纪以来，环境变化和人类活动干扰导致草地退化日益严重。在华北地区，退化草地面积超过草地总面积的2/3［2］。不合理放牧是导致草地退化的一个重要原因［3-4］，放牧行为直接影响到草地生物量及物种多样性，间接改变草地生态系统物质与能量的分配模式，最终引起生态系统内部生物群落结构和功能的变化［5］。不同放牧强度干扰对草地生态系统会产生不同的影响，多数研究表明过度放牧导致草地生态系统植被盖度和生物量下降、群落结构趋于简化，土壤容重、含水量、有机质以及氮、磷、钾等营养元素含量降低［6］，而中度放牧可能降低具有竞争能力的优势物种的多度，增加亚优势物种的多度，间接增加土壤种子库的物种多样性，提高植物物种多样性和丰富度指数［7］。在我国，牧区缺乏统一、规范的管理，过度放牧情况严重，很多草地由于过度放牧严重退化。作为一种人工保护退化草地自然恢复的措施，围封可以有效恢复植物群落的结构和生产力，增加土壤有机质、氮、磷等养分含量［8-9］。此外，也有研究发现，封育草地由于所受外界干扰较少，少数优势物种会迅速占据生态位而导致物种多样性指数较低［4］。放牧强度与草地生物多样性响应机制一直是草地生态学的一个研究热点。

丛枝菌根(AM)真菌是一种广泛分布，可与大部分陆生高等植物共生的一类土壤真菌［10］。AM真菌侵染植物根系建成共生体系，宿主植物为菌根真菌提供能量物质，而作为回报AM真菌则帮助宿主植物吸收各种矿质养分，并增强植物的抗逆性。研究表明，菌根真菌的多样性影响到生态系统的物种多样性，AM真菌群落的变化会导致植物群落组成的改变［11-13］。在草地生态系统中，AM真菌是不可忽视的组成部分，对于退化草原的生态恢复具有潜在的重要作用［14］。

以往有关草地生态恢复的研究多侧重于考察植被演替［15-16］，而忽略了地下功能微生物群落的变化。事实上，生态系统是由地上和地下两个部分组成的一个有机整体［17］，通过很多直接或间接的相互作用将这两部分紧密联系在一起。地下生态系统是土壤生物群落及其生存环境共同组成的动态平衡系统［18］，结构上包含土壤基质、地下水循环系统及土壤生物系统，研究内容侧重于土壤生物与环境间的相互作用机制。土壤生态系统可以提供必要的水循环、生物化学循环和能量流，拥有丰富的、可以维持生态系统功能的生物多样性，并且能汇集土壤中的根系、矿质营养及枯枝落叶形成巨大的碳汇和养分库［19］。显而易见，生态系统的恢复不只是地上部植被的恢复，客观上还应包括地下部分土壤肥力和功能微生物类群的恢复。研究表明，植被恢复情况可以直接影响土壤微生物群落的恢复过程［20］，而土壤微生物群落也能直接驱动植物群落的改变［21］。认识草地恢复过程中植物和土壤关键功能微生物类群的协同演替规律，可为科学评价草地生态恢复效果及探索有效生态恢复途径提供理论依据。

本研究以不同放牧强度试验草地为研究对象，调查了围封14a后草地植物群落多样性，并应用第二代高通量测序技术454测序法分析了植物根际土壤中AM真菌群落的组成情况，探讨退化草地生态恢复过程中植物群落及其共生AM真菌的协同演替规律，期望为草地生态系统的恢复与重建提供理论依据。

1 调查样地与研究方法

1.1 样地与样品采集

1.1.1 研究区域自然概况

研究区域位于内蒙古科尔沁沙地中国科学院奈曼沙漠化研究站附近(42°56′N，120°42′E)，海拔358 m，具有明显的温带大陆性半干旱气候特点。年平均气温6.0—6.5℃，年平均降水量366 mm，降水主要集中在6—8月，年均蒸发量1972.8 mm。

1.1.2 样地设置

调查样地原为自由放牧的天然沙质草地，面积约60，000 m2，于1992年刺线围封，在围封区布置梯度放牧强度试验。试验设4个处理:重牧区(HG，6只羊/hm2)、中牧区(MG，4只羊/hm2)、轻牧区(LG，2只羊/hm2)及封育区(CK，不放牧)。各小区面积相等，为75 m×200 m。每年的放牧时间从6月1日开始，9月20日结束。梯度放牧强度试验于1996年结束，此后围封进行生态系统自然恢复。本试验以封育区为对照，研究梯度放牧强度处理后长期封育对地上植被和AM真菌群落恢复的影响。

1.1.3 样品采集

试验样品采集于2010年8月，采样时间距离试验区围封已经14a。取样时在每个试验小区的两端和中间各选择一块样地，样地面积10 m×10 m，在样地四个边角及中心各取一个1 m×1 m的样方，按照方精云等［22］的草本层植物群落清查方法对各小区植被组成、盖度、密度、高度等进行调查统计，并取0—30 cm土层土壤及植物根样。每个样地内的土壤过2 mm筛后混匀，取200 g样品装袋，植物根系样品也混匀后装袋，暂放低温保温箱带回实验室，保存于-80℃冰箱待用。其余土壤样品装袋后带回实验室自然风干，进行理化性质分析。

1.2 样品分析

1.2.1 土壤理化性质测定

土壤有机质采用重铬酸钾氧化法［23］，土壤pH值用电位法，土壤速效N用碱解扩散法，土壤速效磷用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法［24］。土壤全N和全C由元素分析仪(Vario ELⅢ，Elementar company，German)测定［25］。

1.2.2 菌根侵染率测定

采用根段染色-镜检法［26］，从采集的根样中挑出细根剪成1 cm根段，用10%KOH透明、2%HCl酸化、0.05%台盼蓝(Trypan Blue)染色-乳酸甘油脱色。将30条经染色的根段置于载玻片上在显微镜下逐一观测丛枝、泡囊和菌丝着生状况，计算菌根侵染率。

1.2.3 菌丝密度测定

台盼蓝染色-镜检法［27］，取5 g过2 mm筛土壤样品放入带盖塑料瓶中，加入100 mL水和12 mL3.7%六偏磷酸钠溶液，剧烈振荡30 s，静置2.5 min后过0.05 mm筛，收集筛上过滤物于搅拌器中搅拌20 s，静置10 s，吸取5 mL滤液抽滤(滤膜孔径0.22 μm)，台盼蓝染色制片，显微镜下观测，计算菌丝密度。

1.2.4 AM真菌分子鉴定

采用454焦磷酸测序法对AM真菌进行多样性鉴定。该测序方法对各样品片段高通量平行测序，稀有物种的序列也不会丢失。454焦磷酸测序有其固定的测序引物，为了保证多个样品测序同时进行，需要在样品引物的一端添加识别序列bar-code［28］。本试验采用巢式PCR，即需要在第二对引物上添加bar-code，添加完bar-code 的前引物序列为:5′-CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAG(NNNNNNN)TGGAGGG CAGTCTGT C-3′;后引物序列为5′-CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG GTTTCCCGTAAGGCGCC GAA-3′。其中，带下划线部分是测序引物，括号内为7bp的bar-code，斜体部分是样品特异性引物NS31/AM1。NS31/AM1是近年来最常用于测定自然土壤AM真菌群落多样性的引物，其扩增区域位为SSU rRNA，片段大小约为550 bp，满足454焦磷酸测序对片段长度的要求。由于该引物具有一定的偏扩性，不利于无梗囊霉科和类球囊霉科AM真菌的扩增［29］，为弥补NS31/AM1偏扩带来的误差，选用覆盖度更广的AML1/AML2［30］作为第1对引物。该引物能覆盖除Archaeospora trappei以外的所有已知AM真菌。具体测序步骤如下:

1)DNA提取 取500 mg过2 mm筛的混匀鲜土，按照DNA提取试剂盒说明(Fast DNA spin kit for soil，Bio 101，La Jolla，Calif.)进行操作，提取的DNA溶液贮藏于-20℃冰箱待用。

2)Nested-PCR 第1次扩增反应体系25 μL，包括2 μL DNA模板(10—20 ng/μL，由土壤DNA提取液稀释得到)、0.3 μL 25 μmol/L 引物(前后引物各 0.3 μL)、2.5 μL 10×Ex Taq Buffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTP 混合液(各碱基浓度均为 2.5 mmol/L)、0.3 μL 25 μmol/L BSA、0.5 μL 5 U/μL Ex Taq，以及 17.1 μL dd H2O。反应程序为:94℃变性5 min;94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，循环35次;最后72℃延伸10 min。PCR产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测。第1次扩增产物稀释十倍作为第2次扩增反应的模板，第2次扩增体系为50 μL，包括2 μL DNA 模板(10—20 ng/μL，由第1 次扩增产物稀释得到)、0.6 μL 25 μmol/L 引物(前后引物各 25 μmol/L)、5.0 μL 10×Ex Taq Buffer、4.0 μL 2.5 mmol/L dNTP 混合液(各碱基浓度均为 2.5 mmol/L)、0.6 μL 5 U/μL Ex Taq，以及37.2 μL dd H2O。反应程序与结果鉴定方法与第1次扩增相同。

3)纯化 按照纯化试剂盒(QIAEXⅡGel Extraction Kit，QIAGEN Sciences，Maryland)操作说明对第2次扩增产物进行纯化，纯化产物由NanoDrop 1000测定浓度。各样品纯化后DNA等量(每个样品DNA含量150 ng)混合，混合液送上海人类基因组研究中心进行454焦磷酸测序。

4)测序结果分析 454测序得到的序列满足以下3个条件的用作进一步分析:1)包含正确的bar-code;2)有正确的NS31引物序列;3)片段总长超过160 bp(不包括测序引物及bar-code)。进一步分析需要用到MaarjAM数据库［31］，该数据库包含所有已报道的球囊菌门(Glomeromycota)真菌SSU rRNA序列，以相似度≥90%和片段长度不少于query序列10 bp为条件与该数据库比对筛选出属于球囊菌门真菌的序列。筛选出的序列以相似度≥97%及片段长度不小于query序列10 bp为条件进一步与MaarjAM数据库比对，相同序列比对结果即为同一虚拟分类单元(Virtual taxa，VT)。VT是MaarjAM数据库中用以区别不同AM真菌序列的新的分类方法。与以往形态学鉴定不同，MaarjAM数据库中AM真菌不以种作为最基本分类单位，而是用不同的VT加以区分。获得VT分类后，用MOTHUR［32］软件(Version 1.23.1)及其在线平台(http://www.mothur.org)分析AM真菌群落Shannon-Wiener指数，并对不同处理群落结构差异进行显著性分析。AM真菌Margalef丰富度指数及Pielou均匀度指数计算方法与植物丰富度指数及均匀度指数计算方法相同。

1.3 数据处理

1.3.1 物种多样性采用Shannon-Winer指数(H)表示。

植物物种多样性指数计算公式

式中，ni为物种i的个体数，n为群落中所有物种个体数之和;

1.3.2 物种丰富度采用Margalef指数(Ma)表示。

式中，S为物种数目，N为群落中所有物种个体总数;计算AM真菌物种丰富度时，S为VT数目，N为群落中所有VT个体总数。

AM真菌Chao-1 index［33］通过MOTHUR软件及其在线平台计算得到，该指数为AM真菌VT期望值，即AM真菌群落的理论物种丰富度。

1.3.3 物种均匀度采用Pielou均匀度指数(E)表示。

式中，H为Shannon-Wiener指数。计算植物物种均匀度时，S为物种数目;计算AM真菌物种均匀度时，S为VT数目。

1.4 统计分析

采用aRarefactWin软件(Version 1.3)对AM真菌进行Rarefaction分析，检测454测序序列数的充分性。采用R软件(Version 1.0)下的Heatmap builder程序对454测序得到的序列进行处理制作成热图，分析群落中不同物种的丰度。

所有试验数据采用Microsoft Excel进行均值和标准差计算并作图，采用SPSS统计分析软件(SPSS 17.0)对数据进行单因素方差分析，采用邓肯新复极差法(SSR)多重比较检验处理之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

不同试验处理小区土壤理化性质见表1。由于研究区为沙质草地，各处理小区土壤有机质及矿质养分含量均不高。速效N最高为19.60 mg/kg，速效P最高为2.25 mg/kg。重牧区速效P含量仅1.00 mg/kg，显著低于中牧区和轻牧区。其余土壤理化性质指标在各处理之间差异均不显著。

表1 不同试验小区土壤基本理化性质Table 1 The chemo-physical properties of soils from different experimental plots

2.2 植物多样性

各试验处理小区单位面积物种数、植物多样性指数、丰富度指数以及均匀度指数均无显著差异(表2)。

2.3 AM真菌多样性

2.3.1 菌根侵染率和根外菌丝密度

菌根侵染率在不同处理之间无显著差异(表3)。重牧区根外菌丝密度最低，为2.41 m/g土，显著低于轻牧区(3.58 m/g土)，但和其它各小区差异不显著。

表2 不同试验小区植物多样性和丰富度指数Table 2 Plant diversity and species richness in different experimental plots

表3 不同试验小区菌根侵染率和根外菌丝密度Table 3 Infection percentage and hyphal length density of AM fungi

2.3.2 AM真菌总体构成

通过454测序从所有土壤样品共得到60108条有效序列，序列长度160 bp至534 bp，平均长度385 bp。AM真菌序列数为59382条，约占总有效序列的98.8%，各样品菌根真菌序列数不等(1057—9161条)，平均约5830条。所得AM真菌序列以97%相似度与MaarjAM数据库进行比对，最终得到序列总数为51509条，样品之间序列数差异较大，最多为8216条，最少为974条。所有AM真菌序列归类至4目5科7属87 VT。球囊霉属AM真菌有效序列数最多，共50306条，占总序列数97.7%。所有球囊霉属序列归为73 VT，占VT总数83.9%。原囊霉属AM真菌最少，仅有13条序列(占总序列数0.03%)，1个VT(表4)。

表4 454测序获得AM真菌序列数和虚拟分类Table 4 Number of Sequences and VTs of AM fungi from all soil samples by 454 pyrosequencing

2.3.3 物种稀释曲线

由物种稀释曲线可见，当序列数达到2000时，AM真菌VT数上升幅度已非常缓慢，除轻牧区序列数为1633条外，其余各处理序列数均超过4000条达到平台期(图1)，所以本研究AM真菌多样性结果基本可以反映取样区AM真菌群落的真实情况。

2.3.4 AM真菌多样性指数及均匀度指数

如表5所示，中度放牧区Shannon-Wiener多样性指数和Pielou均匀度指数均显著高于封育区，而Shannon-Wiener多样性指数在不同放牧强度小区之间差异不显著，Pielou均匀度指数在中牧区和重牧区也较高，与封育区相比达到显著差异。中牧区单位面积物种数及Margalef丰富度指数相对较高，但经统计分析与其它处理无显著性差异。

2.3.4 Chao-1物种丰富度

表6给出的是各处理的AM真菌实测VT数和经计算得到的Chao-1物种丰富度(期望物种数)。由表中数据可以看出，实测AM真菌VT数与期望AM真菌物种数趋势一致(极显著正相关，r=0.92，P＜0.01)，均为重牧区最多，轻牧区最少，这从一个方面表明试验方法的可信度。对各处理平均序列数进行统计分析，结果表明，封育区平均序列数最多，约6342条，显著高于轻牧区(1634条)，但与另两个处理之间差异不显著(表6)。

图1 不同处理AM真菌物种稀释曲线Fig.1 AMF taxon accumulation curves along the number of sequences obtained from different experimental plots

表5 各处理AM真菌多样性指数和丰富度指数Table 5 Shannon-wiener index and Margalef index in different experimental plots

表6 不同处理实测和理论AM真菌物种数Table 6 Observed and estimated number of species(VT)of AM fungi in different experimental plots

2.3.5 AM真菌群落结构分析

不同小区共有及特有的AM真菌VT如图2所示。所有小区共有的AM真菌有40个VT，其余不同小区间共有的VT数量不一，以封育区和重牧区共有的VT数最多(53个)。封育区特有的AM真菌VT数最多(10个)，而轻牧区最少(2个)。

图3显示各处理小区AM真菌群落的物种组成及丰度信息。封育区优势VT为VT00130及VT00156，轻牧区优势VT为VT00130及VT00214，中牧区优势VT为VT00214及VT00295，重牧区物种丰度较高的VT较多，有VT00063、VT00130及VT00156等。各小区优势VT分布相对较集中，且处理之间存在一定的差异，但由Mothur软件分析不同小区AM真菌群落差异表明，各小区之间的群落结构并无显著性差异。

3 讨论

图2 Venn图-不同处理特有和共有VT数量Fig 2 Number of unique and shared VTs among different experimental plots

草地围栏封育是维护草地生态系统生产力的重要手段，也是牧区开展退化草地恢复治理的有效途径之一。大多数有关草地恢复的研究主要关注植物群落、土壤养分，或是土壤生物群落的变化［34-36］，而对生态系统地上和地下部分的协同关系考虑较少。事实上，生态系统地上部分植物群落和地下微生物群落在物种水平、群落水平及系统水平上均存在互动机制。植物从土壤中吸收水分和养分，并通过根际过程改变土壤环境，进而影响土壤微生物的种类和数量［37］;反之，根际微生物种类和数量的不同也可以改变植物从土壤中获取营养物质的方式和途径，从而促进或抑制植物的生长［38］。显然，对于退化草地的生态恢复过程而言，只有地上植物群落和根际微生物群落均达到稳定状态才可认为达到了生态恢复的最终阶段。本研究分析了封育14a后不同放牧强度草地植物群落多样性、土壤理化性质及AM真菌的群落多样性，结果显示长期封育使得植物群落和土壤肥力基本恢复到与对照区一致的水平(表1和表2)。单桂莲等［16］曾研究过围封年限对典型草原群落结构及物种多样性的影响，结果表明退化草地采用生长季围封措施后，群落生产力与物种多样性增加，群落结构和优势物种地位发生较大改变，在围封14a的时候达到群落盖度和密度的最大值。本研究进一步印证以上的研究结果。另一方面，本研究还发现AM真菌多样性在各处理间存在显著差异，其多样性指数和均匀度指数在中度放牧强度区最高，且显著高于对照处理(表5)。该结果表明不同放牧强度下的草地在封育14a后AM真菌群落的恢复与地上植物群落及土壤肥力的恢复并不一致。换言之，本研究揭示了草地生态恢复过程中植物和土壤微生物群落恢复过程具有不同步性，土壤微生物群落的演替可能较地上植物群落的演替过程缓慢。454焦磷酸测序法为第2代基因测序技术，具有简便、快速、获取信息量大且花费较少的优点，已广泛应用于微生物基因组研究［39］。该方法获得DNA信息量大，保证了稀有AM真菌的可检测性，可以较好的反映自然环境中AM真菌的群落组成，近几年在AM真菌多样性研究中也逐步得以应用［40］。由454测序所获得AM真菌序列可以与MarrjAM数据库进行比对，获得可靠的AM真菌分类结果。MarrjAM数据库［31］收录了所有已知球囊霉门的序列及其相关信息(寄主植物、地理位置等)，并对所有序列进行统一分类和命名。该数据库中不以“种”为最小分类单位，而是统一用虚拟分类单元“VT”表示。本研究中AM真菌序列共归为88 VT，与形态学鉴定及其它分子鉴定方法(如克隆文库)获得的种类数相比，检测到的多样性更高［41-42］。本试验各处理AM真菌物种稀释曲线基本到达平台期(图1)，所测物种丰富度趋势与Chao-1丰富度趋势一致，因而可反映AM真菌群落的真实情况［43］。在研究样区中球囊霉属AM真菌共有73 VT，占AM真菌VT总数的83.9%，为优势属，这与其它研究者所得出的结论一致［41-42］。

图3 各处理小区AM真菌群落物种组成及丰度Fig.3 Composition of AM fungal community and abundance of species in different experimental plots

放牧强度对草地生态系统各功能单元的影响已有很多研究报道。放牧可以影响土壤碳、氮循环［44］，随着放牧强度的增加，土壤有机质、总氮、总硫含量显著降低［45］，地上部植被生物量也有所降低［46］。本试验中，土壤总碳、总氮、速效氮含量以及地上部植物多样性与对照处理相比已经无显著差异(表1，表2)，说明长达14a的封育已基本恢复放牧对植被和土壤的影响。有关放牧强度对AM真菌群落影响的报道也有很多，然而不同研究者得出的结论不一。Tian等人［41］对不同退化程度草地AM真菌多样性进行研究，其结果表明随着放牧强度的增加AM真菌多样性急剧降低。Ba等［47］的研究却显示中度放牧区的物种丰富度及均匀度最高，显著高于其它放牧强度处理。本试验AM真菌多样性指数和均匀度指数也是在中度放牧强度下最高，与Ba等的研究结果吻合，也在特定层面验证了Connell于1978年提出的中度干扰假说［48］。该假说认为对群落实施中等强度的干扰比频繁干扰和不干扰群落的物种多样性要高，而在干扰后群落的恢复过程中，恢复中期物种丰富度最大。中度干扰假说几乎适应于所有生态系统。Sabatier和Molino［49］对圭亚那地区热带雨林的研究与Lindholm等［50］对奥卡万戈三角洲地区浮游生物的研究都表明所研究生态系统的物种丰富度在中度干扰水平下达到顶峰。不过，也有研究表明并不是所有情况下中度干扰处理物种多样性均达到最高，物种多样性也可能在干扰处理下没有相应变化或随着干扰强度增加而降低［51］，这与干扰方式以及干扰的空间、时间条件有密切相关。在本研究中，AM真菌多样性对放牧强度的响应符合中度干扰假说，而植物群落生物多样性并没有表现出同样的规律，这很可能是受到特定时间节点的影响，不同生物类群对环境扰动的响应是不尽一致的。

本研究结果表明，围栏封育14a后梯度放牧草地植被及土壤肥力恢复到对照小区同一水平，但AM真菌多样性在不同处理之间仍存在差异。植被与AM真菌群落恢复程度的不同步性提示我们草地生态系统的退化和恢复是一个地上地下协同演进的动态过程，单一研究某一方面或某一节点都不能反映整体效应。今后的研究应该将生态系统地上与地下视为有机整体，把恢复的动态过程作为研究重点，探索生态系统地上和地下部分的协同演替规律，从而为退化草地的生态恢复及合理利用提供坚实的理论基础。

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