温度、盐度及其互作效应对吉富罗非鱼血清IGF-I与生长的影响

强 俊，杨 弘，王 辉，徐 跑，*，何 杰

(1.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室，无锡 214081;2.南京农业大学无锡渔业学院，无锡 214081;3.广东海洋大学水产学院，湛江 524025)

当环境条件改变时，鱼体可以通过自身调节机制来维持机体平衡。温度和盐度波动对鱼类的生长与激素调控有重要影响［1-2］。在等渗环境中，离子转运所消耗的能量最少，储存的能量可能主要用于鱼体生长［3-4］。然而，也有些学者持相反观点。Imsland等［5］报道，在盐度为15，离子调节所需能量较低时可能更有助于促进大菱鲆(Scophthalmus maximu)的生长。

神经内分泌因子对鱼类的生长和能量代谢起调控作用［6］。生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF-I)和胰岛素作为3个重要的神经内分泌因子，在代谢与促进生长方面发挥着重要作用［7］。GH含量可以直接影响肝脏中IGF-I的分泌。同时，这些激素的产生与分泌受许多外源因子(如:饲料中的营养成分、温度、盐度、光照与季节变化等)直接或间接调控［8-12］。增加温度可以提高大菱鲆［10］和大马哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)［6］血浆 IGF-I的水平;而盐度对大菱鲆血浆 IGF-I水平无明显影响［10］。Mingarro 等［13］也发现，在温度较为适宜的季节，金头鲷(Sparus aurata)血液IGF-I水平较高，鱼体生长速度也较快。同时，IGF-I与鱼类的摄食率、能量代谢、发育、繁殖以及海水中的渗透压调节密切相关［13］。2011年全球罗非鱼产量达到300多万吨，中国罗非鱼产量占全球产量的一半。罗非鱼已成为中国南方地区主要养殖的淡水品种之一。关于盐度调节罗非鱼IGF-I方面的研究较少，仅见Fiess等［1］的报道。Fiess等［1］发现，水温为28℃，在海水或2倍海水中，莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)血浆IGF-I水平高于淡水环境中的。然而，温度与盐度对IGF-I的互作效应以及生长、饲料效率和血清IGF-I之间的关系尚未发现。

本试验采用中心复合试验设计和响应曲面分析法，利用此设计与分析方法不仅可以减少试验次数，降低试验随机误差，而且可以有效的拟合各因素与响应值之间的关系。本研究的主要目的:(1)研究温度、盐度及其互作效应对吉富罗非鱼血清IGF-I与生长的影响;(2)研究温度与盐度的二次效应对血清IGF-I与生长的影响，并建立相关曲面模型;(3)分析特定生长率(SGR)、饲料效率(FE)与血清IGF-I之间的关系。本研究旨在利用最优盐度与温度组合优化罗非鱼的苗种培育以及分析血清IGF-I在盐度驯化过程中的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

试验鱼采自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴基地自繁的第16代“吉富”品系尼罗罗非鱼幼鱼，选择无病无伤，活力强的个体作为试验用鱼。试验前在室内水泥池(水温(27±0.3)℃，pH值7.4±0.2，盐度为0)中暂养10 d，自然光周期。暂养期间使用循环水并且连续充气，每天7:00、11:00和16:00各投喂膨化饲料1次(粗蛋白质为32.0%、脂肪8.0%)，投喂量为体重的8%。

1.2 试验设计与分组

正式试验前先进行罗非鱼幼鱼的预试验，通过单因子试验确定幼鱼可以正常摄食与生长的温度和盐度范围。试验采用中心复合试验设计，本试验的响应值为特定生长率、饲料效率和血清IGF-I，因子为温度(18—37℃)和盐度(0—18)，分别以T和S表示，每个因子的试验水平编码分别为-a、-1、0、1、a(表1)，试验采用2因素5水平，共计13次试验，试验的次序随机，中心组合重复5次，每个试验组合重复3次。具体的温度和盐度组合见表1。

表1 温度与盐度的试验设计组合和结果Table 1 Experimental design of temperature and salinity and results(Mean±SD)

1.3 试验鱼的驯化

试验鱼先进行温度驯化，驯化在450L的塑料桶中进行，用电子恒温棒(量程为20—38℃)和冰袋控温，温差为±0.5℃。温度驯化采用渐进方式，每天温度升降幅不超过2℃。驯化至相应的试验温度后开始进行相应的盐度驯化，用海水晶进行盐度调节，盐度测定使用日本ATAGO S-10E盐度计。盐度调节也采用渐进方式，每天盐度升幅不超过2。驯化至相应的设置后，在此设置下饲养7d。

1.4 试验方法

试验在39个450 L的塑料桶中进行，每个塑料桶添加曝气3 d后的自来水400 L。调节至相应的温度与盐度组合，试验开始前对幼鱼的体重和体长进行测量。试验用鱼体重为(27.64±2.79)g，体长为(9.43±0.46)cm，每个试验组合共放置60尾鱼，每个平行组各20尾鱼。各组初始体重和体长没有显著差异(ANOVA，P＞0.05)。正常投喂1.1中的膨化饲料，每次定量投喂(保证桶底无饲料残留)，日投喂量为体重的4%—8%，试验周期共计56 d。试验期间连续充气，采用虹吸法清除桶底粪便，日换水量1/3，保持换水前后温差不超过±0.5，溶氧保持在5 mg/L以上，pH值7.6±0.2，氨氮和亚硝酸盐分别不高于0.01 mg/L，自然光周期。

1.5 响应指标测定

试验结束前24 h停饲，次日对每个试验组合的全部试验用鱼进行体重测量。

式中，W1、W2为起始时间t1、终末时间t2时的体重(g)、F为总投饵量(g)。试验结束后，每个养殖桶随机选取5尾鱼，用200 mg/L的MS-222作快速深度麻醉，尾静脉采血。血样于4℃冰箱中静置2 h，在4℃，3500 g离心10 min制备血清，上清液移置-80℃冰箱中保存备用。血清IGF-I的测定采用放射免疫分析方法，试剂盒购自上海朗顿生物科技有限公司。

1.6 数据处理

数据测定结果用平均值±标准差(Mean±SD)表示。通过最小二乘法拟合因子与响应值之间的二次多项回归方程为:

采用STATISTICA 8.0软件进行试验设计与结果处理，对温度、盐度与响应值进行的二次多项回归拟合。显著水平为0.05，极显著水平为0.01。

2 结果

2.1 温度、盐度及其互作效应对吉富罗非鱼幼鱼血清IGF-I的影响

温度(T)与盐度(S)对罗非鱼幼鱼血清IGF-I的测定结果见表1，对数据采用最小二乘法进行回归拟合，回归方程系数显著性检验结果列于表2。模型P=0.0002﹤0.01，表明所建立的回归模型极显著;失拟项P=0.2701﹥0.05，表明拟合的模型有效。T和S的一次与二次效应对血清IGF-I有极显著影响(P﹤0.01)(表2)，T×S对血清IGF-I无显著影响(P﹥0.05)。回归系数显示，T效应较S明显。T和S与血清IGF-I之间的实际二次回归方程(1):

该方程的决定系数R2=0.949，说明该模型能解释94.9%响应值的变化，仅有总变异的5.1%不能用此模型解释，该模型拟合程度良好。

表2 回归方程系数显著性检验Table 2 Test of significance for regression coefficient

温度、盐度及其交互作用与血清IGF-I的响应曲面及其等高线图见图1。通过该组动态图可评价试验因素对幼鱼生长的两两交互作用。本试验条件下，盐度为9，温度为18—30℃时，随着温度升高，血清IGF-I水平呈上升趋势。温度对血清IGF-I水平有极显著影响(P﹤0.01)，温度高于30℃时，血清IGF-I水平明显下降;温度为27.5℃，盐度为0—7.5时，血清IGF-I水平逐渐下降，盐度高于7.5时，血清IGF-I水平显著上升。水温为18—37℃时，血清IGF-I水平在盐度为0—18范围内均呈先下降后上升的变化趋势。

图1 温度、盐度及其交互作用对吉富罗非鱼幼鱼血清IGF-I水平影响的响应面和等高线Fig.1 Response surface plot and its contour plot of the effect of temperature and salinity and their mutual interactions on serum IGF-I levels of GIFT tilapia juvenile

2.2 温度、盐度及其互作效应对吉富罗非鱼幼鱼特定生长率(SGR)的影响

温度(T)与盐度(S)对罗非鱼幼鱼特定生长率(SGR)的测定结果见表1，对数据采用最小二乘法进行回归拟合，回归方程系数显著性检验结果列于表3。模型P﹤0.01，表明所建立的回归模型极显著;失拟项P=0.4844﹥0.05，表明拟合的模型有效。T的一次、二次效应与S的二次效应对SGR有极显著影响(P﹤0.01)(表3)，S的一次效应对SGR有显著影响(P﹤0.05);T×S对SGR无显著影响(P﹥0.05)。回归系数显示，T效应较S明显。T和S与SGR之间的实际二次回归方程(2):

该方程的决定系数R2=0.986，说明该模型能解释98.6%响应值的变化，仅有总变异的1.4%不能用此模型解释，该模型拟合程度良好。

表3 回归方程系数显著性检验Table 3 Test of significance for regression coefficient

温度、盐度及其交互作用的响应曲面图及其等高线图见图2。本试验条件下，随着温度升高，SGR呈先上升后下降的变化趋势。盐度为9时，幼鱼在水温为28.4℃环境下生长较快。当盐度为0—18时，SGR随盐度上升呈先上升后下降的变化。水温为27.5℃，盐度为9时，幼鱼的SGR显著高于淡水与盐度18环境中的。水温为18℃—37℃时，SGR在盐度为0—18范围内均呈先上升后下降的变化趋势，温度与盐度之间无互作效应。

图2 温度、盐度及其交互作用对吉富罗非鱼幼鱼特定生长率影响的响应面和等高线Fig.2 Response surface plot and its contour plot of the effect of temperature and salinity and their mutual interactions on specific growth rate of GIFT tilapia juvenile

2.3 温度、盐度及其互作效应对吉富罗非鱼幼鱼饲料效率(FE)的影响

温度(T)与盐度(S)对罗非鱼幼鱼饲料效率(FE)的测定结果见表1，对数据采用最小二乘法进行回归拟合，回归方程系数显著性检验结果列于表4。模型P﹤0.01，表明所建立的回归模型极显著;失拟项P=0.8297﹥0.05，表明拟合的模型有效。T的一次、二次效应与S的二次效应对FE有极显著影响(P﹤0.01)(表4)，S的一次效应对FE无显著影响(P﹥0.05)。回归系数显示，T效应较S明显。T和S与FE之间的实际二次回归方程(3):

该方程的决定系数R2=0.984，说明该模型能解释98.4%响应值的变化，仅有总变异的1.6%，不能用此模型解释，该模型拟合程度良好。

温度、盐度及其交互作用与FE的响应曲面及其等高线图见图3。本试验条件下，盐度为9，温度为18—29℃时，随着温度升高，FE呈上升趋势。温度对FE有极显著影响(P﹤0.01)，温度高于29℃时，FE明显下降;温度为27.5℃，盐度为0—9时，FE逐渐升高，盐度高于9时，FE开始下降;盐度为0—18时，FE在0.73—0.82之间，盐度对FE无显著影响(P﹥0.05)。温度与盐度分别为28.7℃和8.6时，FE较高，为0.82，其可靠性为0.927。水温为18—37℃时，FE在盐度为0—18范围内均呈先上升后下降的变化趋势，温度与盐度之间无互作效应。

表4 回归方程系数显著性检验Table 4 Test of significance for regression coefficient

图3 温度、盐度及其交互作用对吉富罗非鱼幼鱼饲料效率影响的响应面和等高线Fig.3 Response surface plot and its contour plot of the effect of temperature and salinity and their mutual interactions on feed efficiency of GIFT tilapia juvenile

2.4 血清IGF-I与特定生长率的关系

本试验条件下，罗非鱼幼鱼血清IGF-I与特定生长率之间的模型为血清IGF-I=-8.657SGR2+28.276 SGR+2.392(P﹤0.05)，R2=0.496。血清IGF-I水平与特定生长率具有相关性。

2.5 血清IGF-I与饲料效率的关系

本试验条件下，罗非鱼幼鱼血清IGF-I与饲料效率之间的模型为血清IGF-I=-119.47FE2+154.59 FE-24.334(P﹤0.05)，R2=0.698。血清IGF-I水平与饲料效率具有相关性。

图4 吉富罗非鱼幼鱼血清IGF-I与特定生长率的关系Fig.4 Relationship between serum IGF-I and SGR of GIFT tilapia juvenile

图5 吉富罗非鱼幼鱼血清IGF-I与饲料效率的关系Fig.5 Relationship between serum IGF-I and FE of GIFT tilapia juvenile

3 讨论

3.1 吉富罗非鱼血清IGF-I在不同水温下的变化及其与生长和饲料效率的关系

吉富罗非鱼血清IGF-I与饲养水温密切相关。在其它鱼类上也见到相关报道［10，14］，较高温度有助于提高鱼体自身的代谢水平，从而增加血浆中循环IGF-I［10］。同时，血清IGF-I与特定生长率相关，相关系数为0.496，P ﹤0.05。在莫桑比克罗非鱼［15］、大菱鮃［10］和银鲑鱼(Oncorhynchus kisutch)［16］的研究中也发现类似报道。Uchida等［15］报道，血浆IGF-I水平可用作莫桑比克罗非鱼生长速度的考察指标，IGF-I水平与特定生长率呈正相关，相关系数r=0.74(P﹤0.01);Imsland等［10］研究发现，大菱鮃的特定生长率与IGF-I水平呈正相关，相关系数r=0.53(P﹤0.01);Pierce等［16］研究发现，银鲑鱼的特定生长率与IGF-I水平呈正相关，相关系数r2=0.623(P﹤0.0001)。血清IGF-I可以直接调控鱼类生长。然而，本试验中的IGF-I与特定生长率的曲线关系，可能是因为血清IGF-I参与鱼体的能量代谢有关。罗非鱼的饲料效率与血清IGF-I水平同样也有相关性，相关系数为0.698，P﹤0.05。这在以往的银鲑鱼［16］的研究中也发现类似结论，而在大菱鲆［10］的研究中未发现此相关性。IGF-I作为一种促细胞分裂素，通过与IGF-I受体(IGF-IR)的结合，能促进鸟氨酸脱氢酶的活性及细胞内DNA、RNA和蛋白质的生物合成，最终引起细胞的增殖与分化，有助于蛋白质的合成和结缔组织及骨髓的产生，从而促进生长［17］。通过以上分析可以发现，水温可能通过影响血清IGF-I水平来改变生长速度与饲料利用。

3.2 盐度对吉富罗非鱼血清IGF-I的影响

盐度对吉富罗非鱼血清IGF-I有显著影响。在盐度为0—18时，血清IGF-I水平呈先下降后上升的变化趋势。而饲料效率与特定生长率在盐度较低时(7—9)较高，低盐环境下可以促进罗非鱼的生长与饲料效率。这与血清IGF-I水平在盐度为0—18条件下的变化趋势相反，盐度低于7或高于9时可以刺激血清IGF-I水平上升。Fiess等［1］在莫桑比克罗非鱼的研究中也发现类似结论。Shepherd等［18］研究发现，虹鳟(Oncorhynchus myskiss)血浆IGF-I水平随盐度(0—20)上升而上升。Sakamo和Hirano［19］研究也发现，将虹鳟从淡水中转移到盐度为25的环境中时，盐度可以引起鳃和肾脏中IGF-I表达的增加，而肝脏中的表达水平无显著变化。鱼体可能通过GH来诱导渗透压调节器官中IGF-I的表达，从而提高盐度的耐受性［20］。可见，GH/IGF-I轴在鱼类的盐度驯化中发挥着重要作用。IGF-I与渗透压调节相联系，血清IGF-I水平升高有助于维持鱼体自身的平衡。Duan等［21］研究发现，GH/IGF-I轴在鱼类新陈代谢方面发挥着重要作用。因而，本试验中血清IGF-I水平的上升可能归因为，环境温度与盐度的增加提高了鱼体的能量需求。关于激素与细胞内渗透调节物质变化的关系还有待进一步研究。同时，鱼类的营养状况与其它代谢影响因素也可能影响IGF-I分泌，IGF-I受体的表达与血液中IGF-I结合蛋白的数量对IGF-I的功能也有明显影响［22-23］。

3.3 温度与盐度对吉富罗非鱼生长与饲料效率的影响

温度和盐度对吉富罗非鱼生长有显著影响。温度为28—30℃，盐度为7—9时，罗非鱼的生长速度较快。可能由于此水环境下提高了罗非鱼的摄食与饲料效率。温度与罗非鱼生长和饲料效率的关系已见一些报道［3，24］。温度高于33℃时，较高的温度可能对鱼体产生了生理应激，代谢产生的能量主要用于维持机体的衡态，或增加了肠胃的排空速率，从而导致生长与饲料效率的下降［25］。Azaza等［25］研究也发现，水温为30℃时，尼罗罗非鱼的生长速率高于水温为34℃时的。盐度为18时，罗非鱼的生长与饲料效率低于盐度较低时的。不同的鱼类，盐度对其的影响有较大差异，如，平鲷(Cichlasoma urophthalmus)［26］在盐度较高(30)时，生长与饲料效率较高;而金头鲷［27］与大菱鲆［28］在盐度为14—28时，生长与饲料效率较高。盐度对鱼类的生长与饲料效率的影响可能与其自身的渗透压平衡调节有关［10］。通常，在等渗点附近，鱼类的代谢水平较高。Sparks等［29］和王辉等［30］研究也发现，罗非鱼在低盐环境中的日常代谢率显著高于海水中的。在鱼类中，渗透压调节所需的能量占代谢能中的比例较大，往往需要消耗总能量的20%以上甚至高于50%［31］。因此，当罗非鱼远离等渗点时，能量代谢受到抑制，同时，渗透调节又消耗了大量能量，用于生长的能量将减少。盐度为7—9时可能更接近于罗非鱼的等渗点。此时，调节渗透压平衡所需的能量较少，更多能量用于生长需求［32-33］。

3.4 温度与盐度互作效应对吉富罗非鱼生长、饲料效率及血清IGF-I的影响

本试验中，在温度与盐度对吉富罗非鱼特定生长率、饲料效率和血清IGF-I的研究中未发现互作效应，这与强俊等［34］的结论有所不同。强俊等［34］认为，温度与盐度对罗非鱼的特定生长率有互作效应。Watanabe等［35］也研究发现，不同盐度下，温度对红罗非鱼生长和摄食的影响不同，盐度为0时，饲料消耗与生长在温度为27℃较高;而盐度为18和36时，饲料消耗与生长在温度为32℃时最高。可能是由于试验所选取的试验用鱼规格不同。本试验中，罗非鱼的初始体重为27.64 g，高于强俊等［34］的试验中所采用的6.29 g和Watanabe等［35］的0.56—1.2 g。随着鱼体规格的增加，罗非鱼对盐度的适应能力可能有所提高。同时，本试验中发现，温度对罗非鱼生长、饲料效率和IGF-I的影响较盐度明显。因此，本试验未发现互作效应的原因可能来自两个方面:(1)罗非鱼属于亚热带鱼类，温度的主效应影响较强，主效应可能对互作效应有屏蔽作用;(2)在盐度0—18时，盐度对本试验中吉富罗非鱼幼鱼的饲料效率没有显著影响，罗非鱼对盐度的耐受性可能随着生长发育而提高。

本试验中，利用响应曲面方法首次发现，温度与盐度的二次效应对特定生长率、饲料效率和血清IGF-I有极显著影响。这在实际生产中有较高的应用价值。采用Montgomey［36］的方法，对特定生长率和饲料效率进行优化。温度和盐度分别为28.5℃和8.4时，特定生长率和饲料效率分别为2.29%/d和0.82，其可靠性达0.937。建议按照此组合安排罗非鱼生产，提高罗非鱼的养殖效益。同时，应该注意的是其它环境因子(如:酸碱度、溶氧、光照等)和营养状况，可能对罗非鱼的盐度驯化与代谢水平存在影响，需要进一步研究。

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