非综合征型聋患儿SLC26A4基因突变分析＊

戴翔 李隽 胡晞江 童静 向萍霞 刘翎 冷培

耳聋是一种严重影响人类生活质量的常见疾病，在世界范围内，每1 000名新生儿中就有1名耳聋患儿，50%患儿的耳聋与遗传因素有关［1］。在遗传性聋中，综合征型聋（syndromic hearing loss，SHL）占30%，非综合征型聋（non－syndromic hearing loss，NSHL）占70%，在引起NSHL的常见致病基因中，SLC26A4基因突变是仅次于GJB2基因突变而引起常染色体隐性遗传非综合征型聋的致病因素［2］，与前庭水管扩大（large vestibular aqueduct，LVA）密切相关。本研究拟对137例散发非综合征性聋患者进行SLC26A4 基因突变检测，探讨其耳聋的可能病因及SLC26A4基因突变规律。

1 资料与方法

1.1 研究对象 研究对象为经武汉市妇女儿童医疗保健中心耳鼻咽喉科确诊的137例非综合征型聋患者（耳聋组），男73例，女64例，年龄6个月～13岁，平均3.8±3.1岁。其中，双侧聋119例，单侧聋18例；LVA 患者22例，其中双侧LVA 20例，单侧LVA 2例。1例患者（表1 中编号111103）除听力损失外，曾有肾母细胞瘤病史及治疗史，尿液pH 值5.0，较正常范围低，其他系统未见明显异常。其他患者均无其他系统异常，无家族遗传病史，无传染病史，无耳毒性药物应用史。选取听力正常且其他系统无明显异常者126例作为正常对照组，男女各63例，年龄3～34岁，平均12.7±10.6岁。根据知情同意原则，对受检者采集外周血样本以枸橼酸钠抗凝备查，该项目的伦理论证由武汉市妇女儿童医疗保健中心伦理委员会认可。

1.2 研究方法

1.2.1 听功能与影像学检查 根据受检者年龄及配合程度，对耳聋患者分别进行纯音测听及听性脑干反应（ABR）检查，听力损失程度分级标准［3］：轻度为20～40dB HL、中度为41～70dB HL、重度为71～95dB HL、极重度为＞95dB HL。对患者进行颞骨CT 检查，从半规管总脚到前庭水管外口的1／2处直径大于1.5mm 即诊断为LVA。

1.2.2 基因组DNA 提取与PCR 反应 应用Ge－nomic DNA Purification Kit（Promega公司）从受检者外周血样本中提取基因组DNA，经紫外分光光度计定量及纯度分析后，保存于－20 ℃备用。

扩增耳聋组和正常对照组所有对象的SLC26A4基因全部21个外显子，外显子1的引物及PCR 反应条件参见Coyle等的研究［4］，其余外显子的引物及反应条件参考文献报道［5］，引物由上海生工公司合成。PCR 反应体系（50μl）：5xBuffer 10μl，dNTP 1μl，Mg2＋5μl，Taq酶1.25U，均由Promega公司提供，引物1μl，DNA 200ng，加去离子水至50μl。PCR 反应在ABI公司9700型热循环仪上完成，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测分析。

1.2.3 DNA 测序与数据分析 应用Cycle－Pure Kit纯化试剂盒（OMEGA 公司）对PCR 产物进行纯化。应用ABI公司3130型基因分析仪进行正反向直接测序，引物与PCR 引物相同。测序结果经Sequencing Analysis 5.2分析，并通过GeneTool与来自NCBI的SLC26A4基因标准序列进行比对，确定突变位点。

2 结果

137例耳聋患者中23例检出SLC26A4基因突变，占16.79%（23／137）；119 例双侧耳聋患者中SLC26A4突变患者约占19.33%（23／119）；18例单侧耳聋患者中未检出SLC26A4基因致病突变。126例正常对照组中未检出SLC26A4基因致病突变。

耳聋组中20 例确诊为双侧LVA，2 例为单侧LVA；双侧LVA 患者中SLC26A4基因突变19例，约占95.0%（19／20）（表1）；单侧LVA 患者中未检出SLC26A4基因致病突变。

表1 23例SLC26A4基因突变患者的耳聋程度、CT 显示LVA 和基因检测结果

本研究共发现11种SLC26A4基因突变，包括4种国际上尚未报道的突变：E29K（c.85G＞A）、R79X（c.235C＞T）、C282G（c.844T＞G）和V285I（c.853G＞A）（图1）；7种已报道突变：IVS7－2A＞G、G197R、K440X、S532R、IVS15＋5G＞A、D669V 和H723R。IVS7－2A＞G 突变患者在所有SLC26A4基因突变患者中约占82.61%（19／23），在双侧LVA 患者中占89.47%（17／19）；H723R 突变在所有SLC26A4基因突变患者中约占13.04%（3／23），在双侧LVA 患者中占15.79%（3／19）；其他突变均只有一例患者。多个物种的Pendrin蛋白在进行同源性比对后，发现4种新发现的突变均位于保守区。

3 讨论

SLC26A4基因定位于7q31，属于离子转运体家族，介导I－／Cl－的转运［6］。小鼠动物模型研究结果显示，SLC26A4基因最早在胚胎期11 天表达于内耳的内淋巴囊，对听力表型的发育至关重要［7］。人类SLC26A4基因突变及其表达异常与听力损失和内耳结构异常密切相关。SLC26A4基因突变是仅次于GJB2突变而引起常染色体隐性遗传非综合征型聋的致病因素，与LVA 和Pendred综合征密切相关。本研究耳聋组中SLC26A4突变检出率为16.79%（23／137），在双侧耳聋患者中约占19.33%（23／119），与很多报道结果相近［2，7］；Wang 等［8］研究发现中国的大前庭水管患者中SLC26A4基因突变检出率为97.9%，本研究中双侧LVA 患者中SLC26A4基因突变检出率为95%（19／20），说明SLC26A4基因突变是中国人NSHL 的常见病因，同时也是引起国人LVA 的主要病因。

SLC26A4基因突变类型繁多，分布于各个外显子或其侧翼序列，可以表现为一致的纯合突变，也可以为任意两种突变的组合，呈复合杂合型突变。迄今为止，在SLC26A4 基因发现突变位点超过200个（http：／／www.hgmd.cf.ac.uk／ac／gene.php？gene=SLC26A4），并且具有明显的种族差异，欧洲人以L236P和T416P最为常见［9］，而中国人、日本人和蒙古人最常见的突变类型分别为IVS7－2A＞G、H723R 和L676Q［10］。本组病例检测出的突变类型中，IVS7－2A＞G 和H723R 是国人LVA 患者中最常见的突变类型，分别占89.47%（17／19）和15.79%（3／19）。IVS7－2A＞G 位于外显子8剪切位点的位置，即内含子7的3’末端，其突变使前体mRNA 不能正常剪接，从而导致Pendrin的翻译发生移框或提前终止，影响Pendrin 的结构和功能［11］，这在IVS7－2A＞G 突变转基因小鼠的研究中也得到证实［12］。H723R 突变使该位置正常的组氨酸变成精氨酸，影响Pendrin 的表达而致病［13］。由于IVS7－2A＞G 和H723R 在国人LVA 患者中的高突变率，因此，将这两个位点的检查作为新生儿耳聋基因筛查的必查项目，已经成为国内学者研究的共识［5，14］。

SLC26A4基因突变的临床表型差异很大，有时同一种突变型在欧美人群中常表现为LVA 合并甲状腺肿的SHL，而在东亚人中却常表现为仅合并LVA 的NSHL，少见甲状腺异常。即使在同一种人群中，SLC26A4基因突变所引起的听力损失程度、前庭水管扩大程度和甲状腺异常的情况也存在差异。目前，无论是在Pendred综合征，还是在非综合征型LVA 中，都没有发现其临床表型与SLC26A4基因型之间的直接关系。耳聋、LVA 和甲状腺异常的表型与SLC26A4基因突变的个数有关［15］，本研究中编号110206和120805的患者检出单等位基因IVS7－2A＞G 杂合突变，CT 结果正常，则进一步证实单等位基因突变不足以引起LVA。有些LVA病例在SLC26A4基因外显子编码区及侧翼序列中只检出一个致病突变，很可能在其内含子或调控区还存在第二个不易被检测到的致病突变；而那些没有检测出SLC26A4基因突变的LVA 患者的发病原因可能就更加复杂了，如：SLC26A4基因表观遗传改变、SLC26A4基因以外其他致病基因、病原体感染等非遗传因素［15］。本研究中，仅有一例双侧LVA 患者未检出SLC26A4基因突变，其病因可能为上述因素中的一种，也可能为多种因素共同作用所至；2例患者（编号为110301和110801）检出单个SLC26A4基因突变，由于没有CT 结果而无法证实是否为LVA，且检出突变是否为致病突变仍未确定，因此，这2例患者的耳聋病因是否与SLC26A4基因突变有关还有待进一步研究。另外，2 例单侧LVA 患者均未检出SLC26A4基因突变，目前，尚无研究证明单侧LVA 与SLC26A4 基因突变有关。本研究中的19 例双侧LVA 均检出双等位基因SLC26A4突变，其听力损失程度为中度到极重度，均未见甲状腺异常；1例患者（编号120503）基因型为IVS7－2A＞G／G197R 复合杂合突变，听力损失为中度，其CT 显示的LVA 不象典型的LVA 那样前庭水管外口大而中段小，反而是外口小于中段。

SLC26A4基因突变型与临床表型的多样性，说明该疾病的发病机制复杂，还有待深入研究。另外，值得一提的是，SLC26A4基因在肾脏中也有表达，然而在由SLC26A4基因突变导致耳聋的患者中却很少见肾功能明显异常，提示在肾脏中，依赖Pendrin的离子转运受到其他机制的保护［16］。本研究中1例LVA 患者（编号111103）曾患有肾母细胞瘤，经手术治疗后病情稳定，其尿液pH 值5.0，较正常范围低，是否与SLC26A4 基因突变有关还需进一步研究。

新突变的发现对完善国人SLC26A4基因突变图谱具有重要意义。本研究新发现的基因突变中，R79X 属无意突变，导致Pendrin 蛋白合成提前终止，是明确的致病突变；E29K 属错义突变，并且和R79X 在同一个明确LVA 表型的患者中形成复合杂合突变，属致病突变的可能性极大；C282G 和V285I均属错义突变，且均位于保守区，同时在126例正常对照组中未检出，可能属致病突变，然而携带这两种突变的患者均属于单等位基因突变，且是否为LVA 无法确定，其致病性有待进一步研究。今后的工作将围绕新突变展开功能研究，为阐明SLC26A4基因突变的致病机制提供依据，并为完善耳聋分子诊断奠定基础。

1 刘学忠，欧阳小梅，Denise Y，等.中国人群遗传性耳聋研究进展［J］.中华耳科学杂志，2006，4：81.

2 Smith RJ.Clinical application of genetic testing for deafness［J］.Am J Med Genet A，2004，130（A）：8.

3 Azaiez H，Yang T，Prasad S，et al.Genotype－phenotype correlation for SLC26A4－related deafness［J］.Hum Genet，2007，122：451.

4 Coyle B，Reardon W，Herbrick JA，et al.Molecular analysis of the PDS gene in Pendred syndrome［J］.Hum Mol Genet，1998，7：1 105.

5 袁永一，王国建，戴朴，等.大前庭水管相关SLC26A4基因热点突变区域筛查方案探讨［J］.中华耳科学杂志，2010，8：292.

6 Scott DA，Wang R，Kreman TM，et al.The Pendred syndrome gene encodes a chloride－iodide transport protein［J］.Nat Genet，1999，21：440.

7 Wangemann P.The role of Pendrin in the development of the murine inner ear［J］.Cell Physiol Biochem，2011，28：527.

8 Wang QJ，Zhao YL，Rao SQ，et al.A distinct spectrum of SLC26A4mutations in patients with enlarged vestibular aqueduct in China［J］.Clin Genet，2007，72：245.

9 Campbell C，Gucci RA，Prasad S，et al.Pendred syndrome and possible genotype－phenotype correlations［J］.Hum Mutat，2001，17：403.

10 Wu CC，Yeh TH，Chen PJ，et al.Prevalent SLC26A4mutations in patients with enlarged vestibular aqueduct and／or mondini dysplasia：a unique spectrum of mutations in Taiwan，including a frequent founder mutation［J］.Laryngoscope，2005，115：1 060.

11 Park HJ，Shaukat S，Liu XZ，et al.Origins and frequencies of SLC26A4（PDS）mutations in east and south Asians：global implications for the epidemiology of deafness［J］.J Med Genet，2003，40：242.

12 Lu YC，Wu CC，Shen WS，et al.Establishment of a knock－in mouse model with the SLC26A4c.919－2A＞G mutation and characterization of its pathology［J］.PloS One，2011，6：e22 150.

13 Yang JJ，Tsai CC，Hsu HM，et al.Hearing loss associated with enlarged vestibular aqueduct and Mondini dysplasia is caused by splice－site mutation in the PDS gene［J］.Hear Res，2005，199：22.

14 李隽，历建强，王秋菊，等.678例新生儿听力和聋病易感基因联合筛查结果分析［J］.听力学及言语疾病杂志，2010，18：419.

15 Ito T，Choi BY，King KA，et al.SLC26A4genotypes and phenotypes associated with enlargement of the vestibular aqueduct［J］.Cell Physiol Biochem，2011，28：545.

16 Lang F，Vallon V，Knipper M.Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2007，293：1 187.