听觉剥夺后大鼠听皮层神经元的形态学变化和SHP－2基因的表达△

黄河银 刘砚星 徐鸥 王玉杏 路虹

听觉剥夺是指通过药物致聋、噪声致聋和双侧耳蜗毁损致聋等方法引起听觉外周器官在结构和／或功能上的退变，进而再逐级影响听觉中枢的间接性退变。听觉中枢结构自下而上主要包括蜗神经核、上橄榄核、外侧丘系、下丘、内侧膝状体和听皮层。借助听觉剥夺的实验造模方法，相关的研究领域可延伸至神经核团、神经递质、神经投射、基因调控和神经元细胞凋亡蛋白酶等若干方向［1］，以期从这五个互不相同但却彼此相关的方面明确听中枢结构和功能的可塑性变化。蛋白酪氨酸磷酸酶2 型（src－homology domain containing protein tygosine phosphatase type 2，SHP－2）基因在细胞核中的激活机制对神经系统有着重要影响，其中间产物参与了多条信号通路的调节，分别对细胞的生长和分化施以正向调控［2］。本研究拟通过观察双侧耳蜗毁损后2个月内大鼠听皮层神经元细胞的形态学变化及SHP－2基因的表达变化，探讨SHP－2对听皮层神经元细胞凋亡的调控作用和听觉中枢的可塑性机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及处理 选择生后2周的SPF级雄性SD 大鼠48只，检测双耳ABR 反应阈均在15dB SPL以内，然后将其随机分为4个实验组（2周组、4周组、6周组、8周组）和4个相应对照组，每组6只。实验组动物行双侧耳蜗损毁术，对照组只予麻醉和耳后切口，不做耳蜗毁损。术后对实验组动物再行ABR 检测，以双耳反应阈均在90dB SPL以上为造模成功。在相同条件下饲养各组至对应的时间点后，提取实验动物的双侧大脑听皮层，制作免疫组织化学切片，观察形态学变化，并用RT－PCR技术检测SHP－2的表达情况。本研究经医院动物伦理委员会批准通过。

1.2 双侧耳蜗损毁术［3］按8 ml／kg 给予动物5%水合氯醛溶液麻醉，然后在双侧耳后约1cm×1 cm 的区域沿耳后沟作长约1.5cm 的弧形切口，分离皮下筋膜，向后牵拉胸锁乳突肌上份，暴露面神经，沿面神经走行向上分离至茎乳孔处，暴露听泡，剥离听泡表面的筋膜，然后用探针在听泡表面前中1／3处钻孔，进入鼓室，暴露鼓岬。用探针在鼓岬隆起处钻孔，见透明的淋巴液溢出，改用钩针从钻孔处小心伸入并适度旋转，绞毁蜗轴和骨螺旋板，用一小块明胶海绵放于术腔鼓室内，贯穿缝合切口，将大鼠置于安静而黑暗的环境中保温复苏，术后1周拆线。

1.3 ABR 检测 于术前及各组大鼠术后第2天行ABR 检测，用水合氯醛溶液行腹腔注射麻醉，在鼻尖、鼻背、额顶、双侧耳廓背面备皮。ABR 检测（北京麦德林医疗器械公司，型号ZCS－CAARTREP）在隔声屏蔽室内进行，记录电极置于大鼠额顶正中，参考电极置于耳廓背面，接地电极置于鼻尖鼻背处。将耳机妥善固定于离外耳道口1cm 处，用滤波短声刺激，极性交替，刻度0.5μV，速率21.1s，增益50k，脉冲宽0.1 ms，扫描时间10 ms，叠加1 000次，步距5dB，以波Ⅲ刚出现的最稳定的刺激声强度为反应阈［4］。

1.4 听皮层取材 动物饲养至规定时间后，实验组和对照组同时取材。用水合氯醛溶液行腹腔注射麻醉，在肋缘平面作横切口，分离皮下组织。沿前正中线剪开胸腔，暴露心包。左心室快速灌注生理盐水5min，然后继续灌注4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液10 min。项部锐性断头，从枕骨大孔沿颅骨矢状缝向前剪开颅骨，翻剥两侧顶骨，直至完整取出双侧大脑半球，制作蜡块。蜡块包埋前，参照《大鼠脑立体定位图谱》［5］，保守确定听皮层所在区域，于前囟后方3.14mm（即对耳线前方5.86mm）处沿冠状面垂直下刀，确定为听皮层区域的前界，再于前囟后方6.30mm（即对耳线前方2.70mm）处沿冠状面垂直下刀，确定为听皮层区域的后界。梯度酒精脱水和二甲苯溶液透明后，以冠状面作为切面向下将标本包埋，然后室温下自然冷却2h，即可将冠状面作为切面行连续切片，切片厚度为5μm。

1.5 HE染色和Nissl染色 HE 染色用二甲苯脱蜡2次，无水乙醇洗去二甲苯2次，依次浸入95%、80%、70%酒精水化，苏木精染色。然后1%盐酸酒精分化，1%氨水返蓝，伊红染色，再依次浸入70%、80%酒精脱水，最后95%酒精脱水，无水乙醇脱水，二甲苯透明，直至轻柔甩干，中性树脂封片。Nissl染色用二甲苯脱蜡2次，无水乙醇涮洗3次；然后依次浸入95%、80%、70%酒精水化，再浸入1%焦油紫水溶液，放入37℃恒温箱中染色，最后取出，依次浸入70%、80%酒精脱水，90%酒精分化脱色，镜下可见Nissl小体显示清晰且背景无色后，用无水酒精快速脱水，直至二甲苯透明和最后封片。Nissl染色最主要的目的是见证正常听皮层神经元细胞中胞浆里面嗜碱性的蓝色颗粒或网状结构，即Nissl小体。光镜下观察听皮层神经元的形态、大小、分布以及胞浆、胞核、核仁的对比变化。

1.6 RT－PCR 取材和检测 切取新鲜的听皮层灰质组织，用Trizol试剂提取听皮层神经元细胞总RNA，在各实验组取同等量的RNA 行反转录和PCR。设计目的基因的上游引物为5’－AGAGTCCCC TGCCACCTTGC－3’，下游引物为5’－CTCATCTGAAACTCCTCTGCTGCTG－3’，扩增产物大小为114bp。扩增程序为95 ℃变性10 min，95℃10s，55℃30s，72℃40s，循环40次。结果用ABI 7500型荧光定量PCR 仪，以2－△△CT法进行数据的相对定量分析，目的基因mRNA 的相对表达量以同一反应体系中实验组的荧光定量指数与对照组的比值来表示。

1.7 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，实验组和对照组的ABR 反应阈比较用配对t检验，RT－PCR 的结果用随机区组方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠术后一般状况和ABR 检测结果 术后第2天，大鼠即能自由活动，无斜颈和口角偏斜，行动能保持平衡，但与对照组相比，实验组动物反应迟缓，耳廓反射消失。各组大鼠在饲养过程中均无切口红肿等感染迹象。实验各组听觉剥夺造模手术后ABR 反应阈均显著升高，与造模前及对照组比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）（表1）。

表1 各实验组听觉剥夺造模前后及对照组ABR反应阈（dB SPL，±s）

表1 各实验组听觉剥夺造模前后及对照组ABR反应阈（dB SPL，±s）

注：＊ 与实验组造模前及对照组同期比较，P＜0.01

2w4w6w8w实验组造模前组别13.3±2.47 12.5±2.61 12.9±2.57 13.3±2.46实验组造模后95.8±1.03＊ 95.4±1.98＊ 95.1±1.83＊ 96.5±0.90＊对照组12.9±2.57 12.9±2.57 12.5±2.61 13.7±2.26

2.2 各组大鼠听皮层神经元细胞形态比较 HE染色可见，对照组正常的听皮层细胞呈饱满圆形，染色浅，分布均匀，胞浆和胞核清晰可见；与对照组相比，各实验组都有不同程度的神经元细胞体积萎缩，颜色深染，胞浆胞核窥视不清，细胞有不同程度的异形，或呈三角形，或呈菱形，以6周组和8周组为甚，说明双侧耳蜗损毁后大鼠听皮层神经元细胞发生了凋亡，且凋亡情况随时间延长而加重（图1）。Nissl染色可见类似的情况，正常的听皮层细胞呈饱满圆形，染色浅，分布均匀，胞浆和胞核清晰可见，可见Nissl小体；与对照组相比，实验各组出现数量不等的异形细胞，体积有不同程度的萎缩，颜色深染，胞浆胞核窥视不清，Nissl小体消失（图2）。

2.3 各组大鼠听皮层神经元SHP－2基因的表达 SHP－2基因的相对表达量（相对于对照组）在2周组为1.1±0.28，4周组为1.5±0.04，6 周组为2.5±0.08，8周组为11.0±0.06，随时间延长，相对表达量逐渐升高，各组之间的差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

图1 听觉剥夺后各组听皮层神经元细胞的HE染色（HE×400） a～e分别为2周组、4周组、6周组、8周组及对照组

图2 听觉剥夺后各组听皮层神经元细胞的Nissl染色（Nissl染色×400） a～e分别为2周组、4周组、6周组、8周组及对照组

听觉剥夺后，听中枢神经元细胞凋亡趋势会与日俱增并且不可逆转，外周听器的细胞数量急剧减少，传入神经系统会以减少传入信号的方式将损害信息传递给听觉中枢，后者为了使外周听器适应损伤后的病理状态，会导致自身和外周都发生结构和功能的可塑性变化，拓宽外毛细胞的调谐曲线，提高神经纤维的兴奋阈值，以代偿听觉中枢的损伤［6］。而听觉剥夺后，听皮层在保证听中枢功能随着内外环境的变化做出相应调整的同时，还能以功能重组和信息整合的方式表现出一定程度上的代偿效用［7］。

SHP－2基因是蛋白酪氨酸磷酸酶基因家族中的一员，广泛表达于各种组织的细胞，其N 末端含有2个2型同源性（SH2）结构域，C 末端含有1个蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）结构域和2 个酪氨酸残基。这些特殊的结构决定了SHP－2基因虽然在细胞核中的激活显得较为独立，却对神经系统的发育有着重要影响。在正常状态下，SHP－2 基因的催化活性因SH2结构域和PTP结构域的彼此结合而受抑制，但当含有磷酸化酪氨酸残基的配体与SH2结构域发生特异性偶联后，PTP结构域便会暴露催化位点，解除自身抑制，发挥酪氨酸磷酸酶活性和接头蛋白的功能，参与Ras－ERK 和P13k－Akt等多条信号通路的调节［8］，对细胞的生长和分化施以正向调控。本实验中，听觉剥夺后大鼠听中枢SHP－2基因的表达呈上升趋势，且随时间延长逐渐增高就是因为听觉剥夺使大鼠发生了听皮层神经元细胞的失活，使听皮层的细胞活动处于抑制状态，从而激活了γ－氨基丁酸和突触后抑制作用［9］，解除了SHP－2基因的抑制态，导致其表达随着时间的推移而逐渐增加。

Hensch［10］认为虽然大脑皮层的发生和发育可能维系一生，但早期的经历具有更持久的影响和更重要的作用，这也是本实验之所以选择2周龄大鼠来观察神经元细胞形态学变化的原因。李孟等［11］研究了1个月之内的大鼠同法造模后听皮层突触素的表达情况，发现在术后突触素会因为出芽而短暂增高，第3天最高，然后会因为轴突末梢找不到靶器官逐渐下降，最低至第2周，说明在术后2周以前突触素的活性表达相对较高，“去抑制－邻取代－突触轴”的进行相对较快，由此产生了相对较强的听觉中枢可塑性。从文中结果看，实验组大鼠听皮层灰质在术后第2周时，无论是在细胞形态、染色深浅和数量分布上都表现出相对较弱的凋亡状态，与正常对照组相差不大，与上述结果相符。另外，张萌等［3］借助99Tcm－Annexin V 活体细胞凋亡显像仪研究了大鼠蜗核神经元在第4个月时的凋亡情况，发现实验组的HE染色神经元细胞计数明显减少并且表现出凋亡的特征性改变，从而证明了在术后较长时间内细胞凋亡持续存在，与本实验中8周组的发展趋势相符。

总之，本研究提示，听觉剥夺可导致听皮层神经元细胞凋亡，凋亡的程度随时间延长逐渐加重；SHP－2基因可促进听皮层神经元细胞的增生，增生的程度也随时间延长而加重；在这两个相互拮抗的因素中，凋亡是最终的结果。

1 Franklin SR，Brunso－Bechtold JK，Henkel CK.Bilateral cochlear ablation in postnatal rat disrupts development of banded pattern of projections from the dorsal nucleus of the lateral lemniscus to the inferior colliculus［J］.Neuroscience，2008，154：346.

2 张薇，杨金莲，胡中倩，等.SHP－2酪氨酸磷酸酶激活突变导致小鼠髓系异常增殖［J］.中国病理生理杂志，2011，27：682.

3 张萌，陈晓巍，田永胜.耳蜗损毁后小鼠听觉中枢的退行性改变［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2009，7：571.

4 Firat Y，Kizilay A，Ozturan O，et al.Experimental otoacoustic emission and auditory brainstem response changes by stellate ganglion blockage in rat［J］.Am J Otolaryngol，2008，29：339.

5 Paxinos G，Watson C，诸葛启钏，主译.大鼠脑立体定位图谱［M］.第3版.北京：人民卫生出版社，2005.图30～图43.

6 Caspary DM，Ling L，Turner JG，et al.Inhibitory neurotransmission，plasticity and aging in the mammalian central auditory system［J］.J Exp Biol，2008，211：1 781.

7 Chance SA，Casanova MF，Switala AE，et al.Auditory cortex asymmetry，altered mini column spacing and absence of aging effects in schizophrenia［J］.Brain，2008，131：3 178.

8 Seta K，Nanamori M，Modrall JG，et al.AT1receptor mutant lacking heterotrimeric G protein coupling activates the Src－Ras－ERK pathway without nuclear translocation of ERKs［J］.J Biol Chem，2002，277：9 268.

9 Boedtkjer E，Aalkjaer C.Insulin inhibits Na＋／H＋exchange in vascular smooth muscle and endothelial cells in situ：involvement of H2O2and tyrosine phosphatase SHP－2［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296：H247.

10 Hensch TK.Critical period regulation［J］.Annu Rev Neurosci，2004，27：549.

11 李孟，华清泉，廖华，等.双侧耳蜗损毁后大鼠听皮层突触素表达的变化［J］.听力学及言语疾病杂志，2008，16：495.