GJB2基因条件敲除小鼠的繁殖、基因型鉴定及听力检测△

万亚蕊 张延平 张晓强 杨仕明

全国性耳聋分子流行病学调查显示，我国大多数重度以上非综合征型聋（nonsyndromic hearing loss，NSHL）由为数不多的几个基因突变所致，其中，最常见的致聋基因是GJB2 基因，21% 的耳聋患者携带该基因突变［1］。GJB2基因突变主要导致先天性NSHL，为常染色体隐性遗传。在中国人中，已检出26%～33%的儿童语前聋患者为GJB2突变所致，占常染色体隐性遗传性聋的28%［2］，目前GJB2突变导致耳聋的确切机制还不完全清楚。GJB2基因位于染色体13q12，编码缝隙连接蛋白26（connxin 26，Cx26）是构成细胞间缝隙连接（gap junction）的重要组成部分，Cx26在哺乳动物耳蜗中广泛存在，它所构成的缝隙连接在维持耳蜗正常生理功能中起重要作用。本研究引进两对转基因小鼠，即Cx26loxp／loxp 和Pax2－Cre／＋小鼠，以便杂交获得GJB2基因条件敲除（conditional connexin 26knock out，cCx26KO）小鼠，为国内进一步研究GJB2基因突变导致耳聋的机理提供研究工具。

1 材料与方法

1.1 实验动物 小鼠引进自美国Emory大学林曦教授实验室。Cx26loxp／loxp小鼠由胚胎干细胞同源重组产生，其中编码Cx26 的第二外显子两侧插入有新霉素选择位点和loxp片段，构建打靶载体，将其转入胚胎干细胞内通过同源重组代替原来的基因序列，经过处理的胚胎干细胞植入假孕小鼠的子宫内，产生转基因小鼠Cx26loxp／loxp。Pax2－Cre／＋小鼠的获得：首先将小鼠Pax2 基因编码序列上游101kb的序列和前三个外显子序列共计121 kb长的基因片段插入细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）中，然后细菌的同源重组作用将IRES－Cre－polyA 插入Pax2基因外显子2中构建打靶载体，通过受精卵原核注射最终产生转基因小鼠Pax2－Cre／＋。将Cx26loxp／loxp和Pax2Cre／＋交配，获得的子代Cx26loxp／－ ＿Pax2Cre／＋小鼠再与Cx26loxp／loxp小鼠交配即可获得 GJB2 基因条件敲除（cCx26KO）小鼠Cx26loxp／loxp＿Pax2－Cre／＋。

1.2 小鼠的饲养和繁殖 引进的小鼠饲养于中国农业大学动物医学院SPF级动物房中，室内温度20～26℃，湿度40%～70%，采用12小时周期昼夜交替照明，小鼠笼盒每周进行一次消毒处理，垫料、饲料和饮水均经过高温高压Co照射灭菌处理；饲养期间，研究员需身穿隔离衣、戴帽子、手套进入动物房，垫料每周换2～3次，每天补充食水一次，记录环境因素，密切观察小鼠的生长繁殖情况。小鼠的性周期为60d左右，母鼠的妊娠期为19d左右，杂合子小鼠Cx26loxp／－＿Pax2－Cre／＋和Pax2－Cre／＋小鼠合笼繁殖，以获得更多的Cx26loxp／loxp＿Pax2－Cre／＋实验用基因敲除动物。

1.3 小鼠的基因型鉴定 由于小鼠Cx26loxp／loxp和Pax2－Cre／＋、雌性小鼠Cx26loxp／＋＿Pax2－Cre／＋和雄性小鼠Cx26loxp／loxp的后代分别可产生两种和四种基因型，故需对子代进行基因型鉴定。

1.3.1 鼠尾基因组DNA 的提取 对出生6天左右未断乳小鼠断趾进行编号，剪取小鼠尾尖0.5～1 cm 放入灭菌的Eppendorf管中，内盛有200μl直接PCR 组织裂解液和4 mg蛋白酶K，混匀后在金属浴中55℃下旋转试管10小时，使其溶解充分，严格按照Phire 动物组织基因组DNA 提取试剂盒（Thermo Fisher Scientific，芬兰）说明书进行操作。EP管内加入0.25μl DNARelease添加剂，涡旋振荡并离心，直至完全溶解。室温放置2～5 min，预热（98 ℃）下孵育2min，离心；移上清至一新管，直接进行PCR 鉴定。

1.3.2 聚合酶链反应（PCR）及电泳 引物设计分别由上海生工合成。引物序列：引物A 上游序列loxpF：5＇－CTT TCC AAT GCT GGT GGA GTG－3＇，下游序列loxpR：5＇－ACA GAA ATG TGT TGG TGA TGG－3＇；引物B上游序列Cre－F：5＇－AGC TAA ACA TGC TTC ATC GTC GGT C－3＇，下游序列Cre－R：5＇－TAT CCA GGT TAC GGA TAT AGT TCA TG－3＇。采用PCR 扩增仪进行循环扩增，设置的反应条件为：反应总体系为10μl，预变性94 ℃5min后，94 ℃变性30s，60～62℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72 ℃延伸8min，4 ℃保持。取PCR 反应终产物3 μl在1%琼脂糖凝胶电泳，Mark作为DNA 分子量标记物，10V／cm 进行电泳，全自动凝胶图像系统分析成像并保存。

1.4 c－ABR 检测 选取P23（出生后24天）的敲基因小鼠和野生型小鼠，使用10%水合氯醛麻醉，置于固定架上，在隔声屏蔽室内用EP 诱发电位仪（TDT）对小鼠行c－ABR 检测。记录电极置于头顶，参考电极插于对侧耳垂，地极置于鼻尖，声音由距小鼠外耳廓1cm 的耳机传入，采用宽频带短声刺激，平均叠加次数1 024次，扫描时间25ms，野生型小鼠先以90dB SPL 刺激，10dB递减，接近阈值时以5dB递减；敲基因小鼠以95dB SPL 刺激，逐级递减并重复2次。以刚能引出可重复波Ⅲ的最低刺激强度为反应阈值。

2 结果

2.1 小鼠基因型的鉴定 Cx26loxp／－＿Pax2－Cre／＋与Cx26loxp／loxp杂交后产生的子代应用2组特异性引物鉴别基因型，子代小鼠基因型PCR 鉴定部分结果见图1，14、18编号小鼠为loxp引物出现一条322bp 扩增条带，为Cx26loxp／loxp 纯合；15、16、17编号小鼠出现两条288bp和322bp扩增条带，为Cx26loxp／－杂合；15、16、18编号小鼠Cre引物扩增的结果出现700bp的扩增条带，为Pax2－Cre／＋，14、17等未出现扩增条带，为Pax2－Cre阴性。证明18号小鼠的基因型为Cx26loxp／loxp＿Pax2－Cre／＋，为cCx26KO 小鼠，可作为今后实验用动物模型。

2.2 各种基因型小鼠的繁殖情况 通过亲代Cx26loxp／loxp和转基因小鼠Pax2－Cre／＋配对，成功地繁殖出子代小鼠，每胎约5～6只，成活率＞93%，其基因型分别为Cx26loxp／－＿Pax2－Cre／＋或者Cx26loxp／－，各占50%，Cx26loxp／－＿Pax2－Cre／＋小鼠与Cx26loxp／loxp小鼠再次杂交，子代经PCR 鉴定共有四种基因型，即Cx26loxp／loxp＿Pax2－Cre／＋、Cx26loxp／－ ＿Pax2－Cre／＋、Cx26loxp／loxp、Cx26loxp／－ 各 占 约 25%，Cx26loxp／loxp＿Pax2－Cre／＋即为cCx26KO 小鼠。以上繁殖结果均符合孟德尔遗传定律。各种基因型代表的含义见表1。

图1 Cx26条件诱导性敲除小鼠PCR 基因分型鉴定结果

表1 各种基因型代表含义

2.3 ABR 检测结果 c－ABR 检测结果显示野生型小鼠ABR 波形规则，随着刺激强度逐渐降低，波Ⅲ振幅逐渐降低、潜伏期逐渐延长，反应阈约45dB SPL。而cCx26KO 小鼠在90dB SPL 刺激强度下仍未见到明显的波Ⅲ，继续加大刺激声强度至95 dB SPL后出现形状欠规则的波Ⅲ，说明与野生型小鼠相比，敲基因小鼠的ABR 反应阈明显增高。

3 讨论

基因敲除又称基因打靶或定点同源重组，是20世纪80年代后期发展起来的新兴技术，它是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术，通过条件基因打靶还可以实现在特定的时间和特定的基因位点不表达目的基因，为生物医学和临床遗传病的研究提供了全新的研究手段。本实验从国外引进Cx26loxp／loxp、Pax2－Cre／＋两种转基因小鼠，在国内繁殖GJB2基因条件敲除小鼠模型，并对此类模式动物的繁殖和基因型鉴定规律进行探索。

GJB2基因广泛表达于内耳、肝脏、胎盘等组织中，构成的缝隙连接是细胞之间重要的通讯联络通道。完全剔除GJB2基因后将导致胎盘葡萄糖转运缺陷，导致敲基因小鼠胚胎期死亡［3］，因此只能采用条件基因敲除方法获得GJB2基因敲除小鼠。实现内耳条件基因敲除首先需要Cre－loxp系统，其次还需要在内耳特异性表达的基因担任Cre重组酶的驱动子。Cre－loxp系统是噬菌体P1 的位点专一性重组系统，Cre重组酶是重组酶Int 家族中的成员，能介导两个同向的loxp位点间DNA 片断的特异性切除。Pax2基因编码核转录因子在胚胎发育阶段广泛表达于中脑－后脑边界、肾脏、视泡、脊柱、嗅基板和耳板组织中，Pax2是内耳原基耳板的早期标记物之一，几乎在每个发育的耳囊细胞中都有表达，因此被研究者选为产生基因条件敲除小鼠的定位基因［4］。由于构建的载体中含有Pax2基因的启动子和内耳特异性表达成分以及Cre，因此在构建的转基因动物中，Cre 重组酶便被特异性地在内耳发育时表达，若此时遇到同时在内耳表达的两个同向loxp／loxp，便可特异性将内耳中两个loxp／loxp之间的Cx26基因特异性切除，从而产生仅耳蜗缺失该基因的条件基因敲除小鼠。

在动物繁殖中，本研究先将转基因动物Cx26loxp／loxp 和Pax2－Cre／＋进行交配，由于Cx26loxp／－＿Pax2－Cre／＋的雄性小鼠无繁殖能力，因此子代中基因型为Cx26loxp／－＿Pax2－Cre／＋的雌性小鼠再与Cx26loxp／loxp 雄性小鼠进行杂交，即可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠Cx26loxp／loxp＿Pax2－Cre／＋。

由于需要从后代中挑选特异性基因敲除小鼠进行后续实验，故必须进行基因型鉴定。根据loxp 与Cre重组酶的敲除原理，只要在基因组DNA 中检测loxp 位点和Cre 重组酶基因的有无就可判断幼鼠的基因型。对突变小鼠进行鉴定的常用方法包括Southern杂交和PCR 法，最常用的简便而快捷的方法为PCR 法。基因型鉴定分为直接法和间接法两种，直接从耳蜗组织提取DNA 进行PCR 为直接基因型鉴定，但取材复杂，通常用作获得基因型后的下游实验［5］。由于获取转基因小鼠时已经将loxp和Cre基因插入动物的基因组DNA，虽然上述两个基因不在鼠尾组织中表达，但可以通过PCR 方法检测其基因序列的存在，故可用鼠尾组织进行基因型鉴定。本研究用于基因型鉴定的PCR 引物设计时，将引物A 的上游序列定位于Cx26第二外显子的上游，引物A 的下游序列定位于Cx26第二外显子的中间［6］，loxp的长度约为20bp，因此loxp纯合则有322bp 条带，loxp 杂合则有322bp 和288bp 两条条带；野生型不含loxp位点，则只有288bp的一个条带，即：loxp／loxp=322bp，wt／wt=288bp，wt／loxp=288bp＋322bp；基因组有Cre插入则出现700bp的条带，否则没有条带。

通过对小鼠ABR 检测结果显示，随着刺激强度的增加，野生型小鼠ABR 的波Ⅲ分化良好，反应阈基本正常，而基因敲除小鼠Cx26loxp／loxp＿Pax2－Cre／＋在刺激强度达到90dB SPL时未引出典型的波Ⅲ，继续增加刺激强度波形分化仍差，说明Cx26敲基因小鼠在P23 时听力显著下降，证实了PCR 方法的可行性以及鉴定结果的准确性。此结果与前期研究发现此种小鼠模型在P18（出生后第19天）时出现典型的外毛细胞凋亡、在P21（出生后第22 天）时外毛细胞片状缺失相一致［7］。说明GJB2基因的缺失可导致小鼠内耳缝隙连接通道功能受损，引起内耳细胞凋亡，使小鼠表现为重度或极重度的感音神经性听力损失。

本研究成功地对Cx26loxp／loxp、Pax2－Cre／＋小鼠进行了保种和繁育，并探索出了此类小鼠的繁殖、基因型鉴定的规律，为在国内进行非综合征型聋发病机制的研究提供了模式动物。

1 Dai P，Yu F，Han B，et al.GJB2mutation spectrum in 2063 Chinese patients with nonsyndromic hearing impairment［J］.J Transl Med，2009，7：1.

2 韩明昱，戴朴.我国耳聋基因诊断的临床应用进展［J］.北京医学，2011，33：419.

3 Gabriel HD，Jung D，Bützler C，et al.Transplacental uptake of glucose is decreased in embryonic lethal connexin26－deficient mice［J］.J Cell Biol，1998，140：1 453.

4 Ohyama T，Groves AK.Generation of Pax2－Cre mice by modification of a Pax2 bacterial artificial chromosome［J］.Genesis，2004，38：195.

5 郝海邦，杨承忠，岳碧松.条件性基因敲除：骨髓细胞特异性敲除Ncol2 基因小鼠的建立和基因型鉴定［J］.四川动物，2011，30：961.

6 Cohen－Salmon M，Ott T，Michel V，et al.Targeted ablation of connexin26in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death［J］.Curr Biol，2002，12：1 106.

7 Zhang YP，Zhang X，Sun Y，et al.Apoptosis progression in the hair cells in the organ of corti of GJB2conditional knockout mice［J］.Clinical and Experimental Otorhinolaryngology，2012，5：1.